SUU, Alm.del - 2020-21 - Bilag 106: Orientering om redegørelse om regeringens beslutningsgrundlag, der relaterer til de forskningsmæssige resultater og anbefalinger ift. mink, fra sundheds- og ældreministeren

Sundhedsudvalget 2020-21
SUU Alm.del Bilag 106
Offentligt

Assessing cross-neutralization activity for SARS-CoV-2 spike mutants

SSI 02. November 2020, Anders Fomsgaard, professor & Maria Magdalena Lassauniere, senior

researcher

SSI has so far identifed seven unique mink mutations/changes in the spike protein the sars-cov-2

variants in mink and infected peiople with contact to the farms. We have tested the first variant

from farm-1 and here we have tested a variant with four simultaneous changes in the spike. This

variant is dominating farm-6, 9, 10, 14, 18 (CHCNR 99768, 10967, 92288, 91966, 97712) and in the

present experiments we isolated this same mink variant virus from a human patient and used it to

evaluate if this virusvariant was sensitive or not to neutralizing antibodies (antisera) from a

collection of convalescent individuals.

Virus culture

A mink and human clinical sample containing the SARS-CoV-2 virus with the spike mutations of interest

is identified. The virus is grown on mammalian cells, a monkey kidney cell line named VeroE6, from

the clinical sample in two subsequent rounds. Priorto use, nucleotide sequencing of the isolated virus

is used to confirm that the cell culture process did not introduce additional mutations that were not

present in the original clinical sample. To date, all viruses evaluated for cross-neutralization of antisera

were identical in the spike protein compared to that found in the clinical sample.

Neutralization assay in Biosafety-3 laboratory

To determine if a mutant virus has reduced sensitivity to existing neutralizing antibodies, a

predetermined amount of the mutant virus is mixed with serially diluted sera from patients that were

infected with SARS-CoV-2 early in the Danish epidemic. The same sera is mixed with the same amount

of virus from a strain that does not have the spike mutations. The virus and sera are incubated for 1

hour to allow the antibodies in the sera to bind to the virus. The virus/antibody mix is added to VeroE6

cells and incubated for 24 hours. Those antibodies that neutralize the virus will block its abilityto infect

cells and thus lead to a lower amount of virus present in the cells. After 24 hours, the amount of virus

in the cells are measured by fixing the cells to the cell culture plate. This fixation process exposes the

virus proteins produced during the infection of the cells. One of these proteins is the SARS-CoV-2

nucleocapsid protein. In a standard ELISA targeting the nucleocapsid protein, the amount of virus is

determined. Using appropriate controls for each virus evaluated, a 50% cut-off value is calculated. The

serum dilution at the 50% cut-off value is reported as the neutralization titer.

Results

Convalescent sera from 9 people (10 serum samples were tested, but one was inconclusive, so only 9

are reported) previously infected with SARS-CoV-2 early in the Danish epidemic were used to evaluate

cross-neutralization activity against a mutant virus. Each serum sample was tested in duplicate with

the mutant virus and the reference virus (without spike mutations).

Serum sample — Neutralisation Titer

Reference virus

Mutant virus

% Difference

-28%

-93%

-83%

-55%

186

-64%

>1280

846

606

-28%

186

-71%

291

177

-39%

SUU, Alm.del - 2020-21 - Bilag 106: Orientering om redegørelse om regeringens beslutningsgrundlag, der relaterer til de forskningsmæssige resultater og anbefalinger ift. mink, fra sundheds- og ældreministeren

The mutant virus resulted in reduced neutralization activity for 8 out of 9 sera tested when compared

to a virus that lacks the spike mutations. The effect varied between the sera and ranged from a

reduction of 25% to as high as 93% neutralization activity.

In conclusion, this indicate that mink virus variants with four of the seven identified mink-

rnutations/changes in the spike protein show less sensitivity (resistance) for neutralizing antibodies

from persons with previous covid-19 infection. It is important to note that these results are

preliminary and are in the process of being confirmed in an independent repeat experiment, but

suggest that mink-specific mutation potentially can influence virus' sensitivity to protective

antibodies,

STATENS

SERUM

INSTITUT

03. november 2020

Notat

Orientering om fundet af ny virusvariant i mink

Virusmutationer er små ændringer i virus arvemateriale, som opstår løbende i forbindelse med at

virus kopierer sig. Jo flere virus, der kopieres, jo større er sandsynligheden for, at der opstår

mutationer. En virus arvemateriale og hermed eventuelle mutationer kan afdækkes ved

helgenomsekventering. Der er blandt minkvarianterne af SARS-CoV-2 (det coronavirus, der

forårsager COVID-19) set flere eksempler på ændringer i spike proteinet. Nogle af disse

ændringer er unikke idet de relaterede til, at virus tilpasser sig mink. Spike proteinet er væsentligt,

idet mennesker efter en naturlig infektion danner antistoffer over for spike proteinet, og de

potentielle COVID-19 vaccine kandidater er også baseret på dette protein. Der er derfor en risiko

for, at effekten af spike-baserede anti-COVIDI9 vacciner kan være påvirket, når der sker

ændringer i denne del af arvematerialet.

Tilstedeværelsen af et omfattende reservoir af virus i mink indebærer en alvorlig trussel mod

folkesundheden, idet virus spredes fra dyr til mennesker. Risikoen for mutationer gør denne risiko

særlig alvorlig. Denne bekymring blev rejst af Statens Serum Institut da de første mutationer blev

påvist. Det blev dog vist, at de nuværende vaccinekandidater vil kunne dække de variationer af

virus, der er opstået blandt mennesker henover foråret. SSI har på nuværende tidspunkt

identificeret syv mutationer i spike proteiner (fundet hos mink og mennesker med tilknytning til

minkfarme). Foreløbige undersøgelser tyder på, at et bestemt virus med fire af disse ændringer i

spike proteiner udviser nedsat følsomhed for neutraliserende antistoffer fra flere personer med

overstået infektion. Dette er påvist i et laboratorieforsøg, hvor man ser, at det særlige minkvirus

ikke i samme grad hæmmes i vækst af antistoffer som et almindeligt humant-tilpasset SARS-

CoV-2. Dette er bekymrende da det kan have betydning for en kommende COVID-19 vaccines

effekt over for smitte med disse varianter, i særdeleshed såfremt der er tale om vacciner der

primært virker gennem at danne antistoffer. Igangværende undersøgelser vil afdække

problemstillingen yderligere.

Det pågældende virus med fire ændringer i generne for spike protein er påvist i fem nordjyske

minkfarme og i mindst 12 patientprøver, hvoraf mindst fire har tilknytning til minkerhverv.

STATENS i

SERUM

INSTITUT

3. november 2020

Y.:~

MFVM har anerodet SUM ore en risikovurdering ift. human sundhed, hvis minkavlere efter

aflivning af smittede dyr eller pelsning i 2020-sæsonen, fortsætter minkproduktionen ind i 2021

som normalt. Der er alene brugfor en vurdering af risiko, ikkeforslag til mulige h,vninger.

Opsummering

Per 2. november 2020 er der konstateret SARS-CoV-2 smitte på 191 minkfarme. Denne udvikling

er sket til trods for en- intensiv indsats fra myndighedernes side mhp. at begrænse smitten.

Samtidig ses smitte med nye typer SARS-CoV-2 virus, der tilpasser sig mink (minkvarianter) i

lokalbefolkningen, og der er en stærk geografisk og tidsmæssig sammenhæng mellem antal

positive minkfarme og smitteforekomst blandt mennesker. Mink med SARS-CoV-2 udgør et stort

reservoir af virus, der er en stor erhvervsrisiko forbundet med minkavl i smittede områder, og det

er ikke lykkedes at begrænse yderligere spredning til det omgivende samfund. På grund af de

ændringer, der optræder i spike proteinet i flere af minkvarianterne af virus, er der risiko for at

vacciner, der er rettet imod spike proteinet ikke vil give optimal beskyttelse imod de nye virus,

der opstår i mink, og immuniteten fra overstået COVID-19 infektion kan give mindre beskyttelse

mod de nye virusvarianter.

Hvis minkproduktionen fortsættes i Danmark, således at der i 2021 genetableres en stor

population af mink, vurderes det for overvejende sandsynligt, at denne population vil være

modtagelige for smitte. Derudover forventes der stadigt at være SARS-CoV-2 i omløb blandt

mennesker og ingen betydende immunitet i befolkningen før størstedelen af befolkningen er

vaccineret. Dermed er der en betydelig risiko for gentagelse af smittespredning blandt mink og

mennesker, som er set i Vestdanmark i 2020. Dette vurderes at indebære en stor risiko for

folkesundheden, både ved at medføre større sygdomsbyrde blandt mennesker, og ved at et stort

virusreservoir i mink øger risikoen for, at der igen opstår nye virusmutationer, som vacciner ikke

giver optimal beskyttelse imod. Samlet set kan den flokimmunitet, der opnås ved vaccination eller

overstået infektion, risikere at blive svækket eller udeblive. Det må samtidigt forventes at betyde

en væsentlig forringelse af vores muligheder for at bevare epidemikontrol i Danmark, hvilket kan

medføre, at man må indføre yderligere restriktioner og begrænsninger på samfundslivet mv.

Konklusion: En fortsat minkavl under en igangværende COVID-19 epidemi indebærer en

betydelig risiko for folkesundheden, herunder for mulighederne for at forebygge COVID-19 med

vacciner.

Baggrund

Siden primo juni 2020 er der i alt konstateret smitte med SARS-CoV-2 på 191 minkfarme. Disse

er primært beliggende i Region Nordjylland og i Midt- og Vestjylland. Viden om introduktion af

smitte samt konsekvenser for smitte mellem mink og menneske er primært baseret på data fra

Nordjylland. Sammenfattende er det sandsynliggjort, at introduktion af smitte med SARS-CoV-

2 til den første minkfarm er sket ifm. smitte fra menneske til mink i ugerne op til udbruddet.

Efterfølgende er der i juni 2020 set udtalt smittespredning til lokalsamfund ifm udbrud på et

plejehjem, forårsaget af en variant af SARS-CoV-2 udviklet blandt mink (herefter kaldet SARS-

CoV-2 minkvariant). Siden primo august 2020 er der konstateret smitte på 168 minkfarme i

Region Nordjylland — alle med SARS-CoV-2 minkvariant. Sideløbende hermed er der konstateret

en stigende forekomst af SARS-CoV-2 blandt borgere i Region Nordjylland, hvor nu ca.

halvdelen skyldes SARS-CoV-2 minkvariant (for detaljer se Bilag 1).

Der er løbende sket flere mutationer i SARS-CoV-2 minkvariant, hvor der indtil nu er fundet 5

clustre. Derudover er der sket introduktion af to nye SARS-CoV-2-typer i henholdsvis Esbjerg

og Vejle kommuner, som ikke er beslægtede med minkvarianten.

Mutation hos virus

Virusmutationer er små ændringer i virus arvemateriale, som opstår løbende i forbindelse med at

virus kopierer sig. Jo flere virus, der kopieres, des større er sandsynligheden for, at der opstår

mutationer. En virus arvemateriale, og hermed eventuelle mutationer, kan afdækkes ved

helgenomssekventering (WGS). Der er blandt minkvarianterne af SARS-CoV-2 set flere

eksempler på ændringer i spike proteinet. Spike proteinet er væsentligt, idet mennesker efter en

naturlig infektion danner antistoffer over for spike proteinet, og de potentielle COVID-19 vaccine

kandidater er også baseret på dette protein. Der er derfor en risiko for, at effekten af spike-

baserede anti-COVIDI9 vacciner kan være påvirket, når der sker ændringer i denne del af

arvematerialet.

Tilstedeværelsen af et omfattende reservoir af virus i mink indebærer en alvorlig trussel mod

folkesundheden, idet virus spredes fra dyr til mennesker. Risikoen for mutationer gør denne risiko

særlig alvorlig. Mutationer i spike proteinet forekommer også i virus blandt mennesker (på

verdensplan) uden tilknytning til minkfarme, men ikke eller uhyre sjældent de samme mutationer

som opstår i mink. Det er dog blevet vist, at de nuværende vaccinekandidater vil kunne dække de

variationer af virus, der er opstået blandt mennesker henover foråret.

Bekymringen om ændringer i spike proteinet i minkvarianter af SARS-CoV-2 blev rejst af Statens

Serum Institut da de første mutationer blev påvist. Der er blandt minkvarianterne set syv

forskellige mutationer i Spike proteinet og eksempler på op til 4 forskellige ændringer i Spike

proteinet i samme virus. Et bestemt virus med 4 ændringer i generne for spike protein er påvist i

fem nordjyske minkfarme og i 12 patientprøver, heraf 4 med direkte forbindelse med tre af disse

farme (cluster 5). Foreløbige undersøgelser tyder på, at dette virus udviser nedsat følsomhed for

neutraliserende antistoffer fra flere personer med overstået infektion. Dette er påvist i et

laboratorieforsøg, hvor man ser, at det særlige minkvirus ikke i samme grad hæmmes i vækst af

antistoffer fra mennesker, som har været smittet med en ikke-minkrelateret variant af SARS-CoV-

2. Igangværende undersøgelser vil afdække problemstillingen yderligere. Yderligere varianter er

identificeret ved sekvensering men ikke undersøgt for neutralisation endnu. Dette er bekymrende,

da det potentielt kan have betydning for en kommende COVID-19 vaccines effekt over for smitte

med nye minkvarianter, og indebære en risiko for nedsat immunitet over for disse efter overstået

COVID-19 infektion, hvilket har betydning for den enkelte og for flokimmuniteten i samfundet.

Betydning for human sundhed hvis minkproduktion fortsætter som normalt

Hvis minkproduktionen fortsætter som normalt, vil der efter pelsning være et antal levende mink

tilbage som anvendes som avlsdyr til næste års produktion. Antallet svarer til ca. 20% af den

årlige bestand på ca. 17 millioner mink. I lyset af den aktuelle situation vil dette antal bestå af 1)

mink som ikke er smittet med SARS-CoV-2, 2) nogle mink som formodentlig har dannet

antistoffer mod SARS-CoV-2, samt 3) formodentlig nogle mink som er uerkendt smittet med

SARS-CoV-2. Fordelingen af disse grupper er ukendt. Dette betyder, at der i kommende måneder

efter pelsning fortsat vil kunne forventes udbrud og forekomst af smitte med SARS-CoV-2 blandt

mink. Derfor vil der også fortsat være en risiko for smitte fra mink til mennesker.

I forbindelse med påbegyndelsen af næste års avlssæson vil der fortsat være risiko for smitte af

SARS-CoV-2 blandt mink. Blandt mink der ikke har været udsat for smitte med SARS-CoV-2

vil alle mink være i risiko for at blive smittet. Blandt mink hvor der tidligere har været smitte med

SARS-CoV-2 forventes, at der vil

være

en del, der har udviklet antistoffer mod SARS-CoV-2.

Det vides ikke i hvor høj grad, -eller hvor længe-, disse antistoffer beskytter mod ny smitte med

SARS-CoV-2, og det vides ej heller i hvor høj grad disse antistoffer vil blive videregivet til

minkhvalpe. Det vurderes dog, at der i starten af nyfødte mink's liv vil

være

en beskyttelse fra

maternelle antistoffer. Denne beskyttelse antages dog at aftage, således at der efter nogle måneder

igen vil

være

en stor population af mink uden antistofbeskyttelse mod SARS-CoV-2.

Der er foreløbig ikke tegn på, at smitten i minkfarme mindskes over tid. En fortsat tilstedeværelse

af SARS-CoV-2 i minkproduktionen, og det faktum at smitten typisk opdages sent i forløbet i de

enkelte farme, vil medføre en risiko for spredning i forhold til handel med avlsdyr. Derudover vil

risikoen afhænge af den på tidspunktet fundne forekomst af SARS-CoV-2 blandt mennesker.

Såvel starten på første og anden fase i udbruddet skete på tidspunkter med forholdsvis lav incidens

i befolkningen, og det må forventes, at yderligere stigning i befolkningsincidensen vil forøge

risikoen for introduktion af nye virustyper til mink fra mennesker, som senest set i Esbjerg og

Vejle kommuner.

Hvis minkproduktionen fortsættes i Danmark, således at der i 2021 genetableres en stor

population af mink, vurderes det for overvejende sandsynligt, at denne population vil

være

modtagelige for smitte. Derudover forventes der stadigt at være SARS-CoV-2 i omløb blandt

mennesker og ingen betydende immunitet i befolkningen før størstedelen af befolkningen er

vaccineret. Dermed er der en betydelig risiko for gentagelse af smittespredning blandt mink og

mennesker, som er set i Vestdanmark i 2020. Dette vurderes at indebære en stor risiko for

folkesundheden, både ved at medføre større sygdomsbyrde blandt mennesker, og ved at et stort

virusreservoir øger risikoen for, at der igen opstår nye virusmutationer, som vacciner ikke giver

optimal beskyttelse imod. Samlet set kan den flokimmunitet, der opnås ved vaccination eller

overstået infektion, risikere at blive svækket eller udeblive. Det må samtidigt forventes at betyde

en væsentlig forringelse af vores muligheder for at bevare epidemikontrol i Danmark, hvilket kan

medføre, at man må indføre yderligere restriktioner og begrænsninger på samfundslivet mv.

STATENS

SERUM

INSTITUT

3. november 2020

Bilag

Udvikling i SARS-CoV-2 smitte blandt mennesker som følge af smittede minkfarme

Sammenfatning

Omtrent halvdelen af nordjyske tilfælde af humane SARS-CoV-2 er direkte eller indirekte forårsaget af

smittede mink. Dette understøttes af et tidsmæssigt sammenfald mellem lokal forekomst af smittede

minkfarme og tilfælde blandt mennesker forårsaget af SARS-CoV-2 minkvarianten i nordjyske kommuner,

samt af at minkvarianten sjældent eller slet ikke forekommer i områder uden smittede minkfarme.

Såfremt minkfarme i hele landet smittes vil man rimeligvis kunne forvente et lignende billede i andre regioner,

med mindre en effektiv aflivningsstrategi kan nedsætte spredningen fra minkfarme til det omgivende samfund.

Resultaterne tyder således på, at SARS-CoV-2-smittede minkfarme udgør en væsentlig risiko for smitte til det

omgivende samfund på trods af de forebyggende tiltag, i form af værnemidler og andre beskyttende

foranstaltninger, der hidtil er truffet.

Indledning

Dette bilag beskriver den generelle udvikling i forekomsten af bekræftede tilfælde af SARS-CoV-2 i Region

Nordjylland og region Midtjylland fra uge 24 til uge 44, samt hvor stor en andel minkvarianten udgør i forhold

til andre, ikke-minkrelaterede SARS-CoV-2-varianter, i de to regioner i ugerne 24 til 42.

Det er vigtigt at bemærke, at ikke alle prøver bliver WGS-typet (Whole Genome Sequencing), og kun 14,9%

af alle positive PCR-prøver fra Region Nordjylland i den beskrevne periode er sekventeret. Der selekteres ikke

i forhold til hvilke prøver, der sekventeres. Dermed antages det, at andelen af minkvarianter blandt alle prøver

der er WGS typet udgør en repræsentativ andel af alle positive prøver.

Kort beskrivelse af SARS-CoV-2 smitte i minkfarme

Den første fase (Uge 24-27) af minkudbruddet omfattede tre farme, to i Hjørring og en i Frederikshavns

Kommune, hvor mink efterfølgende blev aflivet af forsigtighedsgrunde.

Efter uge 27 blev der ikke observeret flere smittede farme før den fjerde farm blev konstateret PCR-positiv i

uge 33.

Anden fase af minkudbruddet (uge 33 og frem) har indtil 2. november omfattet 188 smittede og 33 mistænkte

minkfarme. I anden fase har man først forsøgt en isolations- og fritestningsstrategi, hvorefter en

aflivningsstrategi blev vedtaget og iværksat. Antallet af smittede farme og den geografiske udbredelse af

områder med smittede farme stiger fortsat. Indtil uge 42 var alle smittede farme smittet med minkvarianten,

der stammer fra den første smittede farm. Senest er der sket introduktion af to nye SARS-CoV-2-varianter i

STATENS

SERUM

INSTITUT

henholdsvis en minkbesætning i Vejle og Esbjerg kommuner, hvilket tyder på, at virus er introduceret fi-a

mennesker, der ikke har været smittet med minkvariant.

STATENS

SERUM

INSTITUT

Region Nordjylland

Inden den første farm blev smittet i juni (uge 24) var der stort set ingen smittede personer i Nordjylland. Den

første fase af udbruddet bestod af tre farme. Her blev minkvarianten af SARS-CoV-2 beskrevet for første gang,

og det blev konstateret, at den danske og de hollandske minkvarianter af virus var forskellige og derfor ikke

led i en fælles smittekæde. Minkvarianten spredte sig via smittede personer med enten direkte kontakt eller via

kolleger eller husstandsmedlemmer mellem de tre første farme, og videre til det øvrige samfund, herunder

plejehjem, hjemmepleje, en busrejse til Bornholm, og omfattede mindst 90 personer. På dette tidspunkt var

minkvarianten den dominerende SARS-CoV-2-variant i Nordjylland (figur 1 og 2).

I perioden mellem den første og den anden fase af minkudbruddet blev der kun fundet få tilfælde af SARS-

CoV-2 i Region Nordjylland blandt mennesker (figur 1), og kun ganske få tilfælde af personer med

minkvarianten (figur 2, tabel 1). Disse personer var bosiddende i flere forskellige kommuner i Region

Nordjylland. Den generelle stigning i smitte blandt mennesker i regionen startede i uge 33 og tog fart fra og

med uge 37 (Figur 1). I denne periode skyldtes den generelle stigning i samfundet primært andre typer end

minkvarianten, som det ses af figur 1 og 2.

800

700

600

500

Ikke sekventeret

400

Ikke minkvariant

M inkvarlant

300

200 -

100

r. .

24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 4142 43 44

Figur 1: Antal tilfælde af SARS-CoV-2 i Region Nordjylland pi-. uge. Fordeling mellem minkvariant (rød) og

andre virus-varianter (gul) er vist.

Figenforklaring: I

alt 14,9% af prøverne er WGS-typet. Højden af hver søjle repræsenterer det samlede antal

positive tilfælde pr. uge i Region Nordjylland. Den røde/gule del af søjlen repræsenterer antallet af

sekventerede prøver. Den grå del af søjlen repræsenterer antallet af tilfælde, hvor virus ikke er sekventeret.

STATENS

SERUM

INSTITUT

100%

901

80%

70%

605.

50%

Ikke minkvariant

40% -

30%

20%

10%

Minkvariant

2412526 1 27 1 28 29 30 31 32 3

1 0

35 36 37 38 !9140141 42143_144

9 16 14 27 32i 0

Ikke minkvarlant 3

Minkvarlent

1 31 18

18 26128 69 64125117 2810j0

i0j2r,16 3

0_01211 7 6

Figur 2*: Fordeling af de sekventerede prøver på minkvariant (rød) og andre SARS-CoV-2-varianter (gul) pr.

uge i Region Nordjylland.

*):WGS-typning er en tidskrævende proces, og derfor vil de nyeste resultater stamme fra personer, der var

positive for 2-3 uger siden. Derfor ses ingen sekvenst•esultater for uge 43 og uge 44 i figur 1 og 2.

Der foretages ingen selektion af prøver i forhold til sekventet•ing, og ud fra de aktuelle sekvensresultater

udgjorde minkvarianten således kun 17,8% (95% Cl 13,2-23,2) af det samlede antal prøver i september,

hvorefter der sås en stigning til 52,9% (95%

43,6-62,2) i de to første uger af oktober (tabel 1). Andelen af

bekræftede humane tilfælde af SARS-CoV-2 i Nordjylland, som skyldes minkvarianten, er stigende (figur 2),

og denne stigning falder sammen med stigningen i antallet af SARS-CoV-2-smittede minkfarme (Etgut 3). I

uge 41 og 42 har minkvarianten således udgjort

ca,

halvdelen af de humane tilfælde i Region Nordjylland

(figur 2 og tabel 1).

Den anden fase af udbruddet af SARS-CoV-2 i minkfarme begyndte i uge 33 i Hjørring kommune, med en

enkelt smittet farm (figur 3). Frem til uge 37 blev kun enkelte farme smittet. Herefter tog udbruddet fart, hvor

flere farme i Hjørring kommune og den første farm i Frederikshavns kommune blev konstateret smittede (figur

3). I takt med at der i Region Nordjylland sås en stigning i antal smittede minkfarme, sås en efterfølgende

stigning i antallet af smittede personer i regionen (figur 1). På denne baggrund kan det konkluderes, at

minkvarianten har spillet en væsentlig rolle for antallet af bekræftede tilfælde af SARS-CoV-2 i befolkningen

i Nordjylland.

STATENS

SERUM

INSTITUT

Tabel 1: Procentvis fordeling af minkvariant og andre typer i Region Nordjylland, samt sikkerheds interval

fordelt på måned.

Ilske minkvariant

Minkvariant

Antal sekventerede

Antal

Andel (95%

Antal

Periode

prøver

Cl)

5(1-13)

95(87-99)

1.6-30.6 2020

71(42-92)

29(8-58)

1.7-31.7 2020

12(6-21)

88(79-94)

1.8-31.8 2020

18(13-23)

242

199

82(77-87)

1.9-30.9 2020

1.10-31.10

53(44-62)

119

47(38-56)

2020

37(33-42)

335

62(58-67)

200

535

1.8-31.10 2020

Brønderslev kommune

Frederikshavn kommune

9 70

n GO

å 50

e; 40

~ 3o

" 20

24 25 26 27 28

9 30 3132 33 34 35 36 37 38 39 40 41

•

12 43 44

2•1 2S 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44

Uf.

uge

Hjørring kommune

17 ^

Jammerbugt kommune

e _

~ 50

~ 40

24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 4142 43 44

U16

71 7'• 21. 72

J r

)h 2 I

J,1

11 V 11 11 V. 11, I t t:

JJ 1111 I r

a4 41 •12 .1 •11

uge

Figur 3: Antal tilfælde af SARS-CoV-2 i udvalgte nordjyske kommuner pr. uge (blå søjler), sammenholdt

med nye smittede farme (orange kurve).

STATENS

SERUM ,,

:",

'~I

INSTITUT

Region Midtjylland

Minkvarianten el, kun set i ganske få af de bekræftede humane tilfælde af SARS-CoV-2 i Region Midtjylland

(Figur 4 og 5). Den første smittede farin i Region Midtjylland blev udpeget til nærmere undersøgelse d. 02.

oktober 2020 (uge 41). Hvis udbrudsforløbet i Region Midtjylland ligner forløbet i Nordjylland, vil det

forventes, at andelen af minkvarianten i befolkningen stiger i de kommende uger. Hvis aflivningsstrategien

har en afbødende effekt, vil denne stigning udeblive eller være mindre udtalt.

1400

1200

1000

goo

Ikke sekventeret

Ikke minkvariant

600

Mhkvariant

400

200

0 a

24 25 26 27 28 29 30 3132 33 34 35 36 37 38 39 40 4142 43 44

Figur 4: Antal tilfælde af SARS-CoV-2 i Region Midtjylland pr. uge. Andel af minkvariant (rod) og andre

typer (gul). Grå: Ej sekventeret.

10055

90%

80%

7056

60%

50%

Ikke minkvariant

40%

Minkvarlant

3050

20%

10%

Ikkeminkvarlant 0

Mtnkvarlant

1 0 1 0 0 0 1 0 1 0_0 0

24125 26 27'28~ 29I30 31 32 33 34 35 36 m 38 39 40 41 42;43 44

1 0 0

17-

9010 68 62 28 85 99 8093

0 0

I 1

f010

0 0 0 0 1 2 3 0 0

Figur 5: Fordeling af de sekventei ede prøver pr. uge i Region Midtjylland

STATENS

SERUM

INSTITUT

Forekomst af SARS-CoV-2

i udvalgte nordjyske kommuner.

Brønderslev kommune

Fra uge 32-40 var andre typer end minkvarianten dominerende, og Brønderslev kommune havde et kendt

udbrud i forbindelse med et

"open

night"

arrangement i Dronninglund, som var drevet af andre typer end

minkvarianten (figur 6). Fra uge 41 dominerede minkvarianten, og der sås igen en stigning i antal bekræftede

tilfælde i kommunen. Den første minkfarm blev mistænkt for SARS-CoV-2 d. 29. september 2020 (uge 40).

Dermed er det sandsynligt, at stigningen i humane tilfælde fra uge 41 og frem primært er drevet af smitte fra

minkfarme.

Ikke sekventeret

Ikke minkvariant

Minkvariant

24 25 26 27 23 29 30 31 32 33 34 35 36 37 33 39 40 4142 43 44

Figur 6: Antal tilfælde af SARS-CoV-2 i Brønderslev kommune pr, uge. Andel af minkvariant (rød) og andre

typer (gul). Grå: Ej sekventeret.

STATENS

SERUM

INSTITUT

Jammerbugt kommune

Før uge 41 sås næsten ingen humane tilfælde af minkvarianten. I ugerne 37-40 sås begyndende smittespredning

i kommunen, men ingen tilfælde af minkvarianten. Fra uge 41 sås en kraftig stigning i antal tilfælde med

minkvarianten som den dominerende type (Figur 7), hvilket stemmer overens med at første SARS-CoV-2-

positive farm i Jammerbugt kommune blev udpeget d. 30-09-20 (uge 40). Også for Jammerbugt kommune

indikerer resultaterne, at den markante stigning i antal humane bekræftede tilfælde af SARS-CoV-2 primært

skyldes minkvarianten, og at smittede farme er en afgørende faktor i denne stigning. Men der forekommer

også smittespredning i Jammerbugt kommune, som ikke er relateret til minkvarianten.

100

Ikke sekventeret

ikke minkvariant

N1inkvariant

24 25 26 27 23 29 30 3132 33 34 35 36 37 33 39 40 4142 43 44

Figur 7: Antal tilfælde af SARS-CoV-2 i Jammerbugt kommune pr. uge Andel af minkvariant (rød) og andre

typer (gul). Grå: Ej sekventeret.

STATENS

SERUM

INSTITUT

Hjørring kommune

I juni dominerede minkvarianten blandt tilfælde af SARS-CoV-2 hos mennesker i Hjørring kommune.

Minkvarianten opstod i den første smittede farm, som var beliggende i Sindal i samme kommune.

Udbruddet var veldokumenteret, og var et eksempel på bred smitte til det omgivende samfund, som beskrevet

i indledningen. I august hvor enkelte farme blev smittet med SARS-CoV-2 i Hjørring kommune (figur 3), sås

sideløbende en stigning i antallet af humane bekræftede SARS-CoV-2-tilfælde (figur 3 og 8). Minkvarianten

udgjorde en betydelig del af det samlede antal sekventerede prøver (Figur 8), men der foregår også smitte, som

ikke er relateret til minkfarme i Hjørring kommune.

Ikke sekventeret

Ikke minkvariant

Minkvariant

24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 4142 43 44

ør-.

1I l..~.~.I.,~

Figur 8: Antal tilfælde af SARS-CoV-2 i Hjørring kommune pr. uge. Andel af minkvariant (rød) og andre

typer (gul). Grå: Ej sekventeret.

STATENS

SERUM

INSTITUT

Frederikshavns kommune

Den ene af de tre første smittede farme frajuni måned lå i Frederikshavns kommune. Dette afspejles i antallet

af tilfælde blandt mennesker på samme måde, som beskrevet for Hjørring kommune ovenfor (figur 8 og 9).

Ved begyndelsen af anden fase var smitten domineret i af andre typer end minkvarianten, men fra uge 38

begyndte minkvarianten igen at udgøre en betydende andel af de sekventerede prøver (Figur 9). Som for de

andre kommuner passer stigningen i forekomsten af humane SARS-CoV-2-tilfælde med minkvarianten

tidsmæssigt samen med at første farm i Frederikshavn blev udpeget i uge 37.

Ikke sekventeret

Ikke minkvariant

N1inkvariant

,1._

24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 4142 43 44

Figur 9: Antal tilfælde af SARS-CoV-2 i Frederikshavn kommune pr. uge. Andel af minkvariant (rød) og

andre typer (gul). Grå: Ej sekventeret.

Mette Trads Steen

Fra:

Sendt:

Til:

Cc:

Emne:

Mathilde Winkel Madsen

3. november

2020 15:42

Ida Krems

Katrine Kaldahl; Mette Trads Steen; Tyra Grove Krause; Anette Gleitze Øøtner; Kåre

Mølbak; Helle Daugaard Larsen; Jannik Fonager; Ole Jensen

SV: Spm vedr. mutation/ny variant

Kære Ida

Listen over kommuner er god nok: den på ældende muterede minkvariant er fundet på fem af de første farme, som

nok ligger geografisk tæt: tre omkri

se nedenfor hvilke) Navne og

adresser er offentligt tilgængelige på:

https://chr.fvst.dk/

Som svar på spørgsmålet om sekventering: Det er SSI vurdering, at vi for prøver modtaget på hverdage, vi vil kunne

analysere op til 24 prøver indenfor 24 timer. Der arbejdes pt på effektiviseringer af arbejdsgangen på SSI og lokale

implementeringer af udstyret på de klinisk mikrobiologiske afdelinger rundt i landet, som med tiden vil kunne øge

volumen af prøver, der kan analyseres og mindske tiden dette tager.

Mvh. Mathilde

Fra: Mathilde Winkel Madsen

Sendt:

november

202015:10

Til: Ida Krems <[email protected]>

Cc: Katrine Kaldahl <I<I<[email protected]<>; Mette Trads Steen <[email protected]>

Emne: SV: Spm vedr. mutation/ny variant

Kære Ida

På nuværende tidspunkt har vi kendskab til at denne mutation findes på farmene 6, 9, 10, 14 og 18, som ligger i

Hjørring og Frederikshavn kommuner. Muligvis en farm mere, det skal jeglige have afklaret.

Jeg vender tilbage med svar på det andet spørgsmål hurtigst muligt.

Mvh. Mathilde

Fra: Ida Krems

<IKRC&sum.dk>

Sendt:

november

202013:59

Til: Mathilde Winkel Madsen

<[email protected]>

Cc: serum

<serumPssi.dk>;

Katrine Kaldahl

<[email protected]>;

Mette Trads Steen

<[email protected]>

Emne:

SV: Spm

vedr. mutation/ny variant

Kære Mathilde

Nu haster spørgsmålet om sekventering mest — hvornår forventer I at kunne svare på det?

VH. Ida

Fra: Ida Krems

Sendt: 3. november 202013:02

Til:'Mathilde Winkel Madsen' <MAWMPssi.dk>

Cc: '[email protected]' <[email protected]>; Katrine Kaldahl <[email protected]>; Mette Trads Steen <[email protected]>

Emne: Spm vedr. mutation/ny variant

Kære Mathilde

Vi skal også bede om svar på (listen over kommuner haster mere end denne — ministersekretærerne rykker os):

•

Er der tegn på andet særligt ved den nye virusvariant/mutation — bliver mennesker mere syge, smitter den

mere el. lign.?

Hvor hurtigt kan prøver fra mennesker sekventeres mhp. at vurdere, om de er smittet med den nye

variant/mutation? (dvs. antal prøver pr, relevant tidsenhed)

Der opstår sikkert flere spm som vi sender løbende. Der er ikke brug for, I skriver notater med svar — svar på mail til

Katrine og mig er fint.

Sig til, hvis der er flere, jeg skal sætte på cc for at lette processerne?

Tak,

VH. Ida

Med venlig hilsen

Ida Krems

Specialkonsulent, Lægemidler og Internationale Forhold

Direkte tlf. 23484611

Mail: IkrPsum.dk

sundheds-og Ældreministeriet • Holbergsgade 6 •

1057 København K • Tlf. 7226 9000 • Fax 7226 9001 • www.sunn.dk

SUNDHEDS-

ÆLDREMINISTERIET

STATENS

SERUM

INSTITUT

4. november 2020

Hvor mange smittede, og hvor mange blev WGS-typet pr region?

Der er konstateret

ca.

50.000 smittede med covid-19?

Hvor mange i Nordjylland?

- Hvor mange af de 10.000 sekventerede var borgere fra Nordjylland?

Hele pandemien.

SSI har WGS-resultater

(whole

genorne

sequencing)

fra 6.844 personer, svarende til 13,8%

af alle positive prøver. Fra Region Nordjylland er der sekventeret prøver fra 691 personer, svarende til 16,7%

af alle positive prøver (tabel La).

Frafonste minkfarm blev smittet.

SSI har WGS-resultater fra 5.103 personer, svarende til 13,5% af alle positive

prøver. Fra Region Nordjylland er der sekventeret prøver fra 535 personer, svarende til 14,5% af alle positive

prøver (tabel l.b) i perioden fra uge 24, hvor første farm blev konstateret smittet og frem.

Tabel La: Hele pandemi-perioden. Oversigt over antal positive personer i alt og fra de forskellige regioner,

fordelt på antal sekventerede prøver, samt opdelt i "Minkvariant" og "Ikke minkvariant'.

Region

(tom)

Hovedstaden

Midtjylland

Nordjylland

Sjælland

Syddanmark

Total

Ikke

minkvariant

2960

1088

491

857

1161

6630

Minkvariant

200

214

Total

antal

sekventerede

2963

1096

691

859

1161

6844

Total antal

positive

583

23872

9142

4139

5867

5991

49594

Andel af prøver, der er

sekventeret

12,7

_ 12,4

12,0

16,7

14,6

19,4

13,8

Tabel

Lb:

Fra og med uge 24, hvor første farm blev konstateret smittet. Oversigt over antal positive

personer i alt og fra de forskellige regioner, fordelt på antal sekventerede prøver, samt opdelt i "Minkvariant"

og "Ikke minkvariant".

Region

(tom)

Hovedstaden

Midtjylland

Nordjylland

Sjælland

Syddanmark

Total

Ikke

minkvariant

2050

949

335

542

955

4889

Minkvariant

200

214

Total

antal

sekventerede

2053

957

535

544

955

5103

Total antal

positive

444

17191

7554

3702

3987

4989

37867

Andel af prØver, der er

sekventeret

13,3

11,9

12,7

14,5

13,6

19,1

13,5

STATENS

SERUM

INSTITUT

, ;.;

. I. II'

Hvor stor en andel af de smittede har minkvarianten i regionerne

Hvor mange af de 10.000 sekventerede var smittet med en mink-variant.

Dette spørgsmål bør besvares pr måned, da der er ret varierende forekomst over tid (tabel 2, figur 1).

Tabel 2: Procentvis fordeling af minkvariant og andre typer i Region Nordjylland, samt sikkerheds interval

fordelt på måned.

Ikke minkvariant

Andel (95% Cl)

Antal

5(1-13)

29(8-58)

88(79-94)

199

82(77-87)

47(38-56)

335

62(58-67)

Mlnkvarlant

Antal

200

Andel (95% Cl)

95(87-99)

71(42-92)

12(6-21)

18(13-23)

53(44-62)

37(33-42)

Antal sekventerede prøver

242

119

535

Periode

1.6-30.6 2020

1.7-31.7 2020

1.8-31.8 2020

1.9-30.9 2020

1.10-31.10 2020

1.8-31.10 2020

Vigtige forudsætninger, som bor undersøges.

Der er nogle vigtige forudsætninger skal være på plads, før vi

kan gange op, og lave et estimat på typesammensætningen for alle positive prøver.

Forskellige teststeder kan have forskellig praksis for indsendelse af prøver til sekventering, hvilket kan have

indflydelse på resultatet af fordeling af sekvenstyper. Først og fremmest bør man lave en sådan opgørelse

regionsvist, fordi der kan være forskel på, hvor stor en del af de positive prøver, der modtages, og hvor mange

af disse, der har en kvalitet, som kan give et brugbart WGS-resultat. Det er.blevet oplyst, at der ikke foretages

nogen form for selektion af de modtagne prøver. Derfor antager vi, at forholdet mellem minkvariant og andre

sekvenstyper er repræsentativt. Og da foreløbige ugeopgørelser og senere opfølgende ugeopgørelser hidtil har

stemt godt over ens, betragtes sekvensresultaterne, med ovenstående forbehold, som repræsentative i

opgørelserne.

Af de sekventerede prøver fra Region Nordjylland siden minkudbruddet startede i juni tilhørte 37% (95% Cl

33-42) minkvarianten. I oktober udgjorde minkvarianten

ca.

53% af.alle sekventerede tilfælde i Nordjylland

(95% Cl 44-62%) (tabel 2).

10096

9096

80%

70%

609'0

5 eS6

Ikke minkvarlant

4096

3096

2096 -

Mlnkvarlant

10%

124;25 26 271 28 29 30~31i32 33

34 35 36 971 36 39 40 41 42!43 44

Ikke minkvartant ~ 3 ~ i

• Møkvariant

0 0 o u 2

4j1

31 18118 26 28

69 64 25

17128 0

21117 6 2

16 14

27132 0 0

4 2J010

Figur 1: Fordeling af de sekventerede prøver på minkvariant (rød) og andre SARS-CoV-2-varianter (gul) pr.

uge i Region Nordjylland.

STATENS

SERUM

INSTITUT

Ugevis opgørelse for Region Nordjylland over fordeling på minkvariant og andre typer kan ses i figur I.

Minkvarianten er meget sjældent forekommende i resten af Danmark (ca. 0,03%).

Hvor mange af de sekventerede er smittet med en mink-variant var fra Nordjylland?

Indtil uge 42, hvor de seneste WGS-resultater stammer fra, fandtes 93,5% af alle minkvarianter i Region

Nordjylland (93,5%, tabel La og l.b), og primært i kommuner med smittede minkfarme. Med stigende

forekomst af SARS-CoV-2 i minkfarme er der også set stigende forekomst i lokalområdet (opgjort pr

kommune. Der henvises til Bilag 1 i notat sendt d. 03. november 2020 "Risikovurdering af human sundhed

ved fortsat minkavl').

Forekomst af SARS-CoV-2 Minkvariant, cluster 5

Er det korrekt forstået:

Af de 10.000 sekventerede var 12 smittet med den mink-variant, som vaccinerne ikke giver optimal beskyttelse

mod?

Nej!

Vi kan ikke sige noget om hvor mange af de 5.103 prøver, der er sekventeret siden udbruddets start i juni, der

tilhører minkvariant, Cluster 5. Cluster 5 er formentlig opstået i august måned i den første farm, der blev fundet

med denne type i Hirtshals. Siden midten af august, hvor den første farm med cluster 5 formentlig blev smittet,

og efterfølgende mistænkt og sat under offentligt tilsyn d. 28. august, er 11 prøver med cluster 5 ud af af 116

prøver med minkvariant fra Nordjylland blevet sekventeret, svarende til 9,5%.

Det tolvte tilfælde med cluster 5 blev fundet på Sjælland, og det er uafklaret om der findes et smittelink til

Nordjylland.

Giver det mening at igangsætte et detektivarbejde ift. smittekæderne i Nordjylland og resten af DK for at sikre

at vi har fuldt overblik over særligt den mink-variant, som vaccinerne ikke giver optimal beskyttelse mod?

Nej, slet ikke. For kun en lille del af alle positive prøver sekventeres, og endvidere er det nok heller ikke alle

positive, der testes. Så det er sandsynligt, at over 80% af personer med minkvariant, cluster 5 aldrig har fået

sekventeret deres prøver. Der er endvidere en forsinkelse på op til tre uger fra testdatoen til resultatet af WGS-

analyserne foreligger, så disse smittekæder vil være umulige at spore.

Skal vi nu gensekventere alle positive test i hele Danmark — eller kun stikprover?

Der er ikke et enkelt svar på dette. Stikprøver kan ikke finde sjældne, men potentielt betydningsfulde typer.

Men det kommer an på strategi og valg af formål. I øjeblikket er strategien, at man ikke selekterer prøver til

sekventering. Denne strategi har en stor fordel, når man skal opgøre f.eks. andel af minkvariant eller andre

undergrupper af virus.

Skal vi gensekventere de "gamle" pi-over, så vi kan se om der er mere end 12?

Der er med overvejende sandsynlighed mere end 12, da kun 12-15% af alle positive prøver sekventeres, og

man må formode, at ikke alle testes. Det er vigtigt at pointere, at man ikke kan bruge antal sekvens-bestemte

prøver som et tal for hvor mange, der findes i alt. De sekventerede prøver er en lille stikprøve af den samlede

mængde smittede. Hvis gamle prøver skal prioriteres nu, vil det betyde, at færre nye prøver kan analyseres.

Og så et lidt andet spørgsmål:

Hvorfor kun i Nordjylland og ikke andre områder med mink. Og hvorfor netop disse nordjyske kommuner

Indtil uge 42, hvor de seneste WGS-resultater er fra, var der stort set kun smittede minkfarme i Nordjylland.

Der er meget stort sammenfald mellem forekomst af smittede minkfarme og SARS-CoV-2 Minkvariant hos

mennesker. Vi så endda, at i den periode henover sommeren, hvor der ikke var positive farme, fandtes kun

meget få tilfælde med minkvarianten i mennesker.

Hvis der kommer flere tilfælde i Vestjylland eller andre minktæfte områder forventes de SARS-CoV-2-typer,

der smitter mink i dette område at udvise en lignende stigning blandt mennesker. Men i områder med store

byer, hvor andre mekanismer driver epidemien, vil minksmitten selvfølgelig fylde mindre. Dette mønster kan

STATENS

SERUM

INSTITUT

også ses ved opgørelse på kommune niveau i Nordjylland. Det vil sige, at minkvariant hos mennesker hænger

nært sammen med, at minkfarme er smittet med samme variant. Andre steder forekommer minkvarianten ikke.

Med nye typer i minkfarme i andre områder vil vi forvente at disse nye typer bliver årsag til smitte af mennesker

i de pågældende områder.

p,J C\Usen'.ØM1App0atn\Lou4Micro:ch\t:indmw.VNetCache\Contenc0utlaok\FINMOXFBR02611 n5 mink_map,html

~;Minkfanm.andCOV101ginfec_ ,-MirtkfartncaedC0VI015in_ —

- C Sag.„

Mink farms and COVID19 infections:

Overview (Aug - Oct, 2020)

Opdatering 06 november, 2020

COVID19 affected tarns and COV1019

individuals on the CPR_MINK list (left);

and CMD19

individuals with WGS confirmed mink-variant

(

right)

August to

October,

2020

}

Krf-f and

tolk cpr mnkhste

smittet

tarn

}

Kds6Q sand

e)ml

nwelanon_minkvanant

m mkrelation

minkvanant

smlttet_farn

6olhmDurg

Golhmhurd

Coponhagon

døv"

UEPItdARK

Coponhogen

COVID19 affected Tarmsand COVID19+ Individuals With WGS confirmed mink-variant

tweedy occurrences

:rom

August to October, 2020

Uge: 37

Klassifikation

Preliminary rapport on SARS-CoV-2 spike mutations arising in Danish mink,

their spread to humans and neutralization data.

SARS-CoV-2 spike mutations arising in Danish mink and their spread to

humans

Statens Serum Institut, 5 Artillerivej, DK-2300 Copenhagen S, DENMARK

Page 1 of 7

Background

Despite control measures, SARS-CoV-2 continued to spread among mini( farms across northern

Denmark, with more than 200 farms infected by November 2020. SARS-CoV-2 genome sequences

obtained from infected mink and humans living on the farms provided evidence of SARS-CoV-2 spread

between mink and human in zoonotic events. This study investigates the amino acid changes in the

spike surface glycoprotein that appeared during this outbreak and their effect on the antigenicity of

the SARS-CoV-2 virus.

Spike mutations

Within the infected mink, the SARS-CoV-2 virus mutated, giving rise to several amino acid changes in

the spike protein. The first was a tyrosine to phenylalanine at amino acid 453 (Y453F), a mutation that

also appeared during the Dutch mink farm outbreaks. It is a conservative amino acid substitution in

the receptor binding domain that directly contacts the host ACE2 receptor at amino acid 34 (Wang et

al). This ACE2 contact position differs between human and mini( (histidine [34H] in humans and

tyrosine [34Y] in mink and other mustelids (Damas et al)), which suggests that Y453F is an adaptation

mutation to mini( ACE2. Importantly, 453F increases affinity for human ACE2, which may explain its

successful introduction and establishment in humans,

Following the appearance of 453F, additional spike mutations were observed in minks and the humans

epidemiologically linked to the infected mink farms (Fig. 1). These include: i) 69-70deltaHV - a deletion

of a histidine and valine at amino acid positions 69 and 70 in the N-terminal domain of the S1 subunit;

ii) 1692V — a conservative substitution at position 692 that is located seven amino acids downstream

of the furin cleavage site; iii) S1147L — a non-conservative substitution at position 1147 in the S2

subunit; and iv) M12291— a conservative substitution located within the transmembrane domain.

Clinical isolates

Efforts are underway to isolate each mink-associated SARS-CoV-2 spike mutant strain that occurs in

people residing in Denmark. To date, Statens Serum Institut in Denmark has isolated two strains of

mink-associated SARS-CoV-2 viruses. These include an isolate with the 453F spike mutation (F-spike)

from cluster 1 and an isolate with a 69-70deltaHV, 453F, 692V, and 12291 mutation combination from

Cluster 5 (hereafter referred to as AFVI-spike). To ensure that subculturing of SARS-CoV-2 clinical

isolates on VeroE6 cells did not induce additional spike mutations, each isolate was sequenced. The

spike protein of the cultured virus was identical to that of the SARS-CoV-2 virus in the original clinical

sample.

Page 2 of 7

Spike mutation combinations*

453F

69-70deIHV, 453F

69-70deIHV, 453F, 1147L

69-70deIHV, 453F, 692V, 12291

Abbreviation Number of positive clinical samples**

AFL

AFVI

N = 142

N = 162

N = 18

N = 12

* All SARS-CoV-2 mink-assoclated sequences also contained the D614G

'* For sequenced samples up until 31 October 2020. May include duplicate samples taken from the same

person and Is therefore not necessarily representive of the number of infected persons.

Spike Trimer

Receptor binding domain (RBD)

,. Y453F

~. '! ,` •

Spike RBD with

host receptor ACE2

N-terminal

domain (NTD)

= L-

ACE2

Deletion of HV

at position 69-70

~RBM

lei

1692V

nearS1152

cleavage

site

' RBD

Envelope

S1147L

the membrane

Y453F

in RØM

M12291 in the

^"'•'•'

••""

transmembrane domain

Figure 1. The mink-associated mutations in the SARS-CoV-2 spike protein. A) The combination and frequency

of mink-associated spike mutations detected in SARS-CoV-2 infected humans B) The crystal structure of a closed

prefusion spike trimer [PDB: 6ZGE] with the position of the Y453F variant in the receptor binding motif, the

position of two amino acids deleted in the N-terminal domain, and the position of the 1692V variant. The regions

encompassing the S1147L and M12291 mutations are not within the crystal structure; however, their relative

positions are indicated. C) The position the Y453F variant in a receptor binding domain complexed with a host

ACE2 receptor [PBD: 6LZG].

48 The clinical isolates bearing the Y453F spike mutation replicated as efficiently as the

unmutated/wildtype SARS-CoV-2 virus that predominates in Denmark (data not shown). Conversely,

the SARS-CoV-2 virus with four mutations grew slower than both the wildtype virus and other SARS-

CoV-2 virus isolates (Fig. 2). The cytopathic effect (CPE) induced by the AFVI-spike mutant virus

appeared later and was less pronounced and had an approximate 10-fold lower titer 24 hours post-

inoculation compared to human SARS-CoV-2 isolates prepared underthe same conditions (Fig. 2A). At

96 hours post-inoculation the AFVI-spike mutant virus titer was comparable to that of the wildtype

Page 3 of 7

virus and exceeded other SARS-CoV-2 viruses isolated and subcultured under the same conditions (Fig.

213). The AFVI-spike mutant virus titer increased 54.7-fold from 24 to 96 hours post-inoculation,

compared to an average of 4-fold (range: 2.6 to 5.7-fold) over the same time for other SARS-CoV-2

isolates. The ability to replicate to high viral titers is consistent with high levels of the AFVI-spike

mutant virus detected in throat swab samples of infected persons, as indicated by an average gPCR

assay (E-Sarbeco) cycle threshold of 24.7 (range: 20-35). Further evaluation of the SARS-CoV-2 AFVI-

spike strain growth kinetics in other cells systems are warranted.

A) Titer of clinical isolates prepared

under the same conditions

Growth kinetics of

clinical isolates

-i

~ 5-

~ 4

F-

~ 3

-w- Wildtype

y AFVI

Isolate 1

-i

fi Isolate 2

24h

96h

`yp\a`

~ ~\a`ø~

Hours post-inoculation

Figure 2. Growth kinetics of the SARS-CoV-2 AFVI-spike mutant virus. A) Virus titers 24h post-inoculation for

SARS-CoV-2 viruses isolated from clinical samples under the exact same conditions. Isolate 1-3 each have

different spike mutations unrelated to mink outbreaks, these include N439K (isolate 1), N439K+69-70delHV

(isolate 2), and S477N (isolate 3). B) The growth kinetics of the AFVI-spike mutant virus relative to other clinical

isolates, including the nonmutated virus (wildtype) that predominates in Denmark and spike mutant viruses

(isolate 1 and 2 as for [Q.

Virus neutralization

The introduction of SARS-CoV-2 spike mutant viruses raises concerns about a potential reduced

recognition of the protein by antibodies induced after SARS-CoV-2 infection or vaccination that may

have implications for re-infections and vaccine efficacy, respectively, To evaluate the effect of the

mink-associated SARS-CoV-2 spike mutant viruses on antigenicity, neutralizing activity of convalescent

plasma from persons who recovered from a SARS-CoV-2 infection and sera from immunized rabbits

were compared between the AFVI-spike mutant virus and an unmutated wildtype virus.

The neutralization activity was tested using a micro-neutralization assay that was adapted from the

World Health Organization protocol for influenza virus neutralization. The assay was developed at

Statens Serum Institut and validated on >300 convalescent plasma/serum samples as well as sera from

vaccinated mice and rabbits. In brief, 2-fold serial dilutions of plasma/sera were pre-incubated with

Page 4 of 7

100

101

102

103

104

105

106

SARS-CoV-2 virus for 1 hour before addition to a monolayer of VeroE6 cells prepared in 96-well plates.

After a 24 hour incubation, the cells were fixed to the plates and the level of virus determined using a

standard ELISA targeting the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. To determine the amount of virus to

add to the assay, clinical isolates are usually titrated at 24 hours and from these titers 100x TCIDso

virus used in the neutralization assay. This equates to approximately 300x TCIDso from titers calculated

96 hours post-inoculation. Due to the difference in growth kinetics of the AFVI-spike mutant virus, the

TCID so titer calculated at 96 hours was deemed to reflect the amount of infectious particles in the virus

stock more accurately than that measured at 24 hours post-inoculation. Thus, each serum samples

were tested in duplicated with 300x TCIDso as calculated from 96 hours post-inoculation titers.

The convalescent plasma was selected from persons living in the South of Denmark, geographically

separated from the mink outbreaks in the North of Denmark, and had a documented SARS-CoV-2

infection at the beginning ofthe Danish epidemic before the mink outbreaks occurred. Since the effect

of the spike mutations on different levels of neutralizing antibodies is unknown, sera with known low

(N=4), intermediate (N=3) and high (N=2) neutralization titers were tested. Each plasma sample

represents a different donor and was tested in duplicate.

The different convalescent plasma were not equally affected by the AFVI-spike mutant virus. The two

plasma samples with high neutralization titers were largely unaffected, while plasma with low and

intermediate titers were more likely to experience a loss in neutralization activity (Fig. 3a). In these

preliminary data from 9 convalescent plasma, an average 3.58-fold (range: 0 to 13.5) reduction was

observed. Only two plasma samples had a greater than 4-fold reduction, a threshold set for

neutralization resistance by Li et aL who evaluated other spike mutants presented on pseudovirus

particles. It is important to note that the findings are preliminary and warrant further investigation in

other SARS-CoV-2 neutralization assays.

Page 5 of 7

107

Low

0 100

? 80

'n 20

L°

Wildtype virus neutralization titer

Intermediate

400

300

200

100

0ia

High

overall change in

neutralization titer

1500-

100

rnr

Wildtype

Fold change in ND50

M AFVI

0.1

4-fold

reduction

Convalescent plasma sample

0.01

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120

121

Figure 3. Neutralization of the

SARS-CoV-2

AFVI-spike mutant virus relative to an unmutated

SARS-CoV-2

virus.

Convalescent plasma from nine individuals with known low, intermediate, or high neutralizing titers

were used to assess the effect of the spike mutations on neutralization activity of antibodies induced following

infection with an unmutated SARS-CoV-2 virus. The neutralization titer was determined as follows: a 50% cut-

off value was calculated using quadruplicate virus controls (prepared for each virus) and cell controls included

on each plate. The titer was calculated as the interpolation of a 5-parameter titration curve with the 50% cut-

off value. The reciprocal serum dilution is reported as the 50% neutralization antibody titre. B) The fold-change

in neutralization titer for the SARS-CoV-2 AFVI-spike mutant virus relative to an unmutated SARS-CoV-2 virus.

The horizontal dotted line indicates a 4-fold reduction. The bars represent the mean of duplicate measurements

with the standard deviation.

Page 6 of 7

122

123

124

125

126

127

PRELIMINARY References

Wang et al (2020) Structural and Functional Basis of SARS-CoV-2 Entry by Using Human ACE2

Damas et al (2020) Broad host range of SARS-CoV-2 predicted by comparative and structural analysis

of ACE2 in vertebrates

Li et al (2020) The impact of mutations in SARS-CoV-2 spike on Viral Infectivity and Antigenicity. Cell

182, 1284-1294

Page 7 of 7