MIU, Alm.del - 2011-12 - Bilag 150: Undersøgelsesrapporter vedr. misdannede ålekvabefisk, fra miljøministeren

Forord ............................................................................................................ 5Sammenfatning............................................................................................. 7Summary ....................................................................................................... 9Introduktion................................................................................................. 11Teratogene effekter af udvalgte stofgrupper............................................. 11Kilder og tilførsel af miljøfarlige stoffer til vandmiljøet .............................. 13Kildepåvirkning på de tre FORMÅL-lokaliteter ......................................... 13Sammenhæng mellem tilførsler og koncentrationer................................. 15Ålekvabbens reproduktionscyklus ............................................................ 16Effekter af miljøfarlige stoffer i ålekvabbe ............................................... 21Misdannelser i danske ålekvabber 2004-2010 ......................................... 21Misdannelser i danske ålekvabber i et internationalt perspektiv .............. 24Biomarkører i forhold til miljøfarlige stoffer og misdannelser.................... 26Sammenhæng mellem miljøfarlige stoffer og misdannelser..................... 27Konklusioner og anbefalinger................................................................... 35Konklusioner ............................................................................................. 35Anbefalinger.............................................................................................. 35Referencer................................................................................................... 37

I forbindelse med den nationale overvågning af vandmiljøet (NOVANA) i årene2004-2008 er der fundet et stigende antal misdannede ålekvabbeunger i danskefjorde. I andre lande, herunder Tyskland og Sverige, er der gjort lignende fundaf misdannede ålekvabbeunger.Der er tidligere blevet gennemført to litteraturstudier i regi af Miljøministeriet,hvilke er afrapporteret i: 1) Misdannet ålekvabbeunger og andre biologiske ef-fekter i danske vandområder. Litteraturudredning (Stuer-Lauridsen et al. 2008)og 2) Kemiske stoffer, der kan føre til misdannelser i fisk. Indkredsning af stofferud fra deres biokemiske virkemekanisme (Halling-Sørensen et al. 2008).Konklusionerne fra disse udredninger var, at ålekvabbeunger med misdannelserer hyppigst forekommende i kystnære områder med menneskelig aktivitet.FORMÅL-projektet (”Et undersøgelsesforløb til atFORklarefund afMisdannedeÅLekvabbeungeri danske fjorde”) er en del af Miljøministeriets tilvejebringelseaf viden, der er nødvendig, for at Naturstyrelsen kan opstille evt. forslag til ind-satser, der kan imødegå biologiske effekter i miljøet.I FORMÅL-projektet er uddybende undersøgelser blevet gennemført på tre lo-kaliteter, Agersø, Roskilde og Frederiksværk i 2009, udvalgt på baggrund afforskelle i forekomst af misdannelser. Ud fra det samlede billede af forekomstog koncentrationer af metaller og miljøfarlige stoffer i muslinger, sediment ogålekvabber er der i projektet udpeget en række kandidatstoffer/stofgrupper sommulig årsag til øget forekomsten af misdannelser hos ålekvabber.Kobber, organotin, polyaromatiske hydrokarboner (PAH’er), dioxin, dioxinlig-nende PCB’er, bromerede flammehæmmere (BFR) blev, sammen med perfluo-rerede stoffer (PFAS), udpeget som stærke kandidatstoffer. Kviksølv, kadmium,og bly kunne ikke udpeges som kandidatstoffer på ovennævnte lokaliteter.I 2010 gennemførtes et laboratorieforsøg, hvor ålekvabbehunner blev ekspone-ret for enkeltstoffer samt for blandinger af miljøfarlige stoffer.Resultaterne fra feltstudiet og laboratorieforsøget er udgivet som rapporter, ogdenne rapport er en samlet analyse af den viden, som er opbygget inden forprojektet, sat i perspektiv i henhold til andre relevante undersøgelser af ålekvab-ber, marine fisk og miljøtilstand.

Projektet FORMÅL (”Et undersøgelsesforløb til atFORklarefund afMisdannedeÅLekvabbeungeri danske fjorde”) er fase 3 i Naturstyrelsens (tidligere By- ogLandskabsstyrelsens) undersøgelsesforløb iværksat for at klarlægge en even-tuel sammenhæng mellem miljøfarlige stoffer og misdannelser. FORMÅL erinddelt i tre trin omfattende 1) et måleprogram, som vurderer vandmiljøets ogålekvabbens tilstand med hensyn til miljøfarlige stoffer, 2) et laboratorieforsøg,hvor ålekvabber blev eksponeret for miljøfarlige stoffer og 3) analyse og over-ordnet sammenfatning (denne rapport).I den samlede analyse er der benyttet data fra FORMÅL-projektet, det nationaleovervågningsprogram NOVANA samt data fra EU-BONUS-projektet BALCO-FISH.Analysen viser, at når ålekvabbehunner bliver eksponeret for blandinger af stof-fer, er effekterne mindre end for visse enkeltstoffer, dvs. der er hæmmende in-teraktioner mellem stoffer. Omvendt kan der også være additive effekter, nårder er flere stofgrupper til stede. En bedre forståelse af disse to typer af interak-tioner kræver dog et større datamateriale med målinger af miljøfarlige stoffer iforbindelse med undersøgelser af misdannelser.Akuttoksiske stoffer, såsom polyaromatiske kulbrinter (PAH’er) og organotin,ser ud til at være de mest betydende stoffer mht. tidlig død af unger. De merelipofile stofgrupper, såsom bromerede flammehæmmere og perfluorerede stoffer,har større betydning for forekomst af andre typer af misdannelser.Der er en stærkere sammenhæng mellem misdannelser i unger og forekomst afmiljøfarlige stoffer i æg end i ungerne, selv om stoffer optages under hele udvik-lingsperioden. Det betyder, at den mest sårbare periode er fra æggene anlæg-ges til ungerne klækkes.Store rumlige og tidsmæssige variationer i frekvens og typer af misdannelserpeger på, at det er de lokale variationer i tilførsler af miljøfarlige stoffer, som eraf betydning.

The Danish Ministry of the Environment has instigated a series of projects withthe aim to clarify whether deformities in eelpout (Zoarcesviviparous)larvae arecaused by hazardous substances. The conclusions of the earlier literature-based projects were that substances such as heavy metals, organotin, polyaro-matic hydrocarbons (PAHs), and halogenated aromatic compounds like dioxins,PCBs and flame retardants, were likely candidates to have caused the deformi-ties.FORMÅL is the third project with the aim to verify whether the candidate sub-stances indeed are the cause for the observed deformities. In order to fulfil theaim, FORMÅL consists of three parts: 1) a field study, 2) laboratory experimentswith eelpout, and 3) an integrated analysis based on both part 1 and 2 of FOR-MÅL, as well as on results from other on-going projects on eelpout.The integrated analysis shows that when female eelpout are exposed to mix-tures of hazardous substances, the effects are smaller compared to when ex-posed to single substances. On the other hand, when additional groups of haz-ardous substances are included there are additive effects. A better understand-ing of these two types of interactions can only be achieved when more data onexposure in combination with analysis of deformities are available.Acutely toxic substances, such as polyaromatic hydrocarbons and organotin,are suggested to be more important for early lethality of embryos, compared tomore lipophilic substances. The less acutely toxic substances, such as bromi-nated flame retardants and perfluorinated substances, increase in importancefor the development of other types of deformities.There is a stronger correlation between deformities and exposure levels ineggs, than in larvae, although uptake of hazardous substances occurs duringthe whole developmental period. Therefore the most sensitive time-periodseems to be from the time that eggs are developed until the fry are hatched.Large spatial and temporal variations in occurrence of deformities, and in differenttypes of deformities, suggest that it is local variation in exposure and sources ofhazardous substances that determine the frequency of deformed broods.

Det overordnede formål med undersøgelsesforløbet var at belyse årsagen tilmisdannelser i ålekvabbeunger. Hypotesen er, at den øgede forekomst af mis-dannelser i fiskeunger er forårsaget af miljøfarlige stoffer, der inducerer toksiskeeffekter og processer, som kan lede til misdannelser. Test af hypotesen og op-fyldelse af det overordnede formål forudsætter kendskab til belastning med mil-jøfarlige stoffer i forhold til forekomsten af misdannelser samt en forståelse afålekvabbens reproduktionscyklus, og derved hvordan ålekvabbens unger kanpåvirkes.Indledningen sammenfatter viden om misdannelser i ålekvabbeunger, som tidli-gere er publiceret i FORMÅL-projektet, videnskabelig litteratur og andre projekt-rapporter med fokus på de udpegede kandidatstoffer.Afsnittet om effekter er en samlet analyse af de forskellige delprojekter i FOR-MÅL, dvs. feltstudiet med ålekvabber i 2009 og laboratorieforsøget i 2010 sup-pleret med bidrag fra BONUS+-projektet BALCOFISH.

Teratogene effekter af udvalgte stofgrupperEt stof der kan fremkalde misdannelser, siges at have teratogene egenskaber.Ved teratogene effekter forstås enhver skade - morfologisk, biokemisk eller ad-færdsmæssig - der er fremkaldt under fosterudviklingen, og som først viser sigved fødslen eller senere.Overførslen af miljøfarlige stoffer fra moderfisken til ægcellerne kan spille envigtig rolle i eksponeringen allerede i de tidlige livsstadier hos fisk. Når miljøfar-lige stoffer inkorporeres i blommematerialet, bliver de en del af embryonets di-rekte fødekilde. Hos levendefødende fisk som ålekvabbe kan både æg og em-bryoner eksponeres for miljøfarlige stoffer fra moderfisken.Hovedparten af data vedrørende toksiske effekter på fisk er fra såkaldtein-vitrostudier, hvor forsøgsforholdene kan kontrolleres, men disse forhold er megetforskellige fra dem, som forekommer i miljøet. Det er derfor forbundet med be-tydelig usikkerhed at forudsige deformiteter i fisk ud fra sådannein-vitrostudier.Teratogene effekter af miljøfarlige stoffer hos fisk og fiskeyngel i laboratoriefor-søg er tidligere rapporteret i Halling-Sørensen et al. (2008) og er her kort sam-menfattet.De rapporterede misdannelser hos fiskelarver eksponeret for bisphenol A ervæskeansamlinger og blødning i blommesækken og i hovedet omkring gælle-buerne samt histologiske ændringer i cellekernerne i leveren. Tilsvarende er detrapporteret, at PCB kan forsinke embryoernes udvikling, medføre deformiteter i11

forkroppen og øge dødelighed. Enkelte studier beskriver, at DDT kan skabe de-formiteter på skelettet og i øjnene hos fiskeyngel, og at DDT-metabolitten p,p-DDE kan inducere en lav rate af hjerte- og rygmarvsdeformiteter hos fisk. Det errapporteret, at TBT kan forårsage effekter på syns- og lugtesansen hos fisk,anormaliteter i fiskelarvers haler, ufuldstændig klækning, ændret morfologi iform af krumninger på rygsøjlen, ændret pigmentering af øjnene samt mang-lende blommesækabsorption.Deformiteter på bl.a. skelettet og blommesækken er blevet observeret hos yngelaf flere fiskearter eksponeret for forskellige PAH-forbindelser. En række studierindikerer, at graden og antallet af deformiteter vokser med koncentrationen afPAH. Adskillige typer af deformitet ses ved eksponering af fiskeyngel forPAH’er. PAH-eksponering af hunner udviste teratogene effekter, herunder in-terne blødninger, ødemdannelse samt øje- og blommesækdeformiteter på af-kommet. Fiskeynglen havde også en reduceret overlevelse i forhold til en kon-trolgruppe, der aldrig var blevet eksponeret. Deformiteter i hjertet og ødemdan-nelse hos fiskeyngel er fundet ved eksponering for dioxin. Desuden er væske-ansamlinger i blommesækken, nedsat vækst, deformiteter på rygsøjlen, reduce-ret hjerterate og underudviklet hjerte, finner og underkæbe blevet observerethos embryoner eksponeret for dioxin.For metaller er det vist, at bly, krom, cadmium, kobber og kviksølv (både somfrit kviksølv og som metylkviksølv) kan medføre misdannelser hos fisk selv vedlave koncentrationer. Skeletdeformitet er observeret hos zebrafiskeyngel vedeksponering for 10 ppm bly. Tilsvarende viser en række undersøgelser, at cad-mium kan forårsage forskellige former for skeletdeformiteter i fiskeyngel. Ryg-marvsdeformitet er set hos yngel af den australske ørred eksponeret for cadmi-um. I laboratorieundersøgelser er det påvist, at kobber kan forårsage deformiteterpå skelettet og i nervesystemet på bl.a. zebrafiskeyngel. Kviksølv er formentligtdet mest potente tungmetal, når det drejer sig om deformitetsdannelse i fiske-yngel. I laboratorieforsøg har både kviksølv og methylkviksølv kunnet deformereskelettet på fiskeyngel ved en eksponering for blot 5 ppb.Flere af de udpegede kandidatstoffer har også hormonforstyrrende effekt på fiskog påvirker derved reproduktionen. Nonylphenol, bisphenol A, DEHP, PCB’er,DDT samt PAH’er kan påvirke hormonsystemet hos fisk. Litteraturen viser ikkeen direkte sammenhæng mellem en hormonforstyrrende effekt og deformitets-dannelser. Det kan dog ikke udelukkes, at hormonforstyrrende mekanismer kanføre til deformiteter (Halling-Sørensen et al. 2008). Metallerne har ikke direktehormonforstyrrende effekt, men kan til gengæld påvirke cellemembran, forstyrreenzymsystemer og ændre metabolismen af stoffer.

Kilder og tilførsel af miljøfarlige stoffer til vandmiljøetVandområder kan potentielt tilføres miljøfarlige forurenende stoffer via spilde-vand fra bl.a. renseanlæg, ejendomme i det åbne land, overfladeafstrømning,afstrømning fra regnvandsbetingede udløb (fælles- og separatkloak), havbrug,industrier med særskilt udledning og landbrug. Herudover er der potentiel tilfør-sel fra forurenede grunde. Endvidere kan skibstrafik potentielt frigive giftstofferfra skibsmalingen samt oliespild, og der kan spredes miljøfarlige stoffer i forbin-delse med klapning, uddybning og oprensning af havne og sejlrender. Endeligkan der tilføres miljøfarlige forurenende stoffer via atmosfærisk deposition. Forden enkelte lokalitet er det vigtigt at vurdere den samlede belastning fra alle kil-der.Landbrug kan være en væsentlig kilde til bl.a. kobber og cadmium. Havbrug kanvære en kilde til kobber fra imprægnering af net og som hjælpestof, samtPCB’er, dioxin og dioxinlignende PCB’er via spild af fiskefoder. Skibstrafik kanvære en væsentlig kilde til organotin, kobber og PAH’er. Oprensning og klap-ning af havnesedimenter kan potentielt sprede store mængder kobber, kadmium,kviksølv, PAH’er, PCB’er, dioxin og dioxinlignende PCB’er i miljøet. Kobber,kviksølv, kadmium, PAH’er, PCB’er, dioxin og dioxinlignende PCB’er kan ogsåtilføres via atmosfærisk disposition.

Kildepåvirkning på de tre FORMÅL-lokaliteterGenerelt findes kun få og varierende data for tilførsel af miljøfarlige stoffer tilvandområder i Danmark, og mange kilder er ikke opgjort. Med de foreliggendedata er det ikke muligt at foretage detaljerede kvantitative lokale opgørelser afbelastningen med miljøfarlige stoffer. I stedet er belastningen på de tre lokalite-ter vurderet ud fra målte niveauer af miljøfarlige stoffer i muslinger, sedimenterog ålekvabber.Undersøgelsen i FORMÅL fokuserer på nøje udvalgte lokaliteter, Agersø i Store-bælt, og Roskilde Fjord ved hhv. Frederiksværk og Roskilde, hvor prøvetagnin-gen af ålekvabber, muslinger og sediment blev gennemført i 2009 (figur1).

Informationer og data om kilder til miljøfarlige stoffer på de tre lokaliteter er søgti rapporter over opgørelse af punktkilder og basisanalyser for vanddistrikter.Lokaliteterne er ikke belastet af klappladser, men spredning af miljøfarlige stof-fer via ophvirvling af sedimenter forårsaget af bølger, stærk strøm og oprens-ning kan forekomme på alle lokaliteter. Kobber, kviksølv, kadmium, PAH’er,PCB’er, dioxin og dioxinlignende PCB’er kan tilføres vandmiljøet på de tre loka-liteter via atmosfærisk deposition, og landbrug kan være en væsentlig kilde tilkobber og cadmium på alle lokaliteter.AgersøLokaliteten ved Agersø er i projektet udpeget som referenceområde, idet fore-komsten af misdannelser hos ålekvabber er lav. I oplandet findes en rækkekommunale og private renseanlæg, hvor flere renseanlæg har direkte udledningtil havmiljøet. Der findes også flere industrier med særskilt udledning (bl.a.Stigsnæsværket, Harboe Bryggeri, Gulfhavn/Kuwait) samt et havbrug og salt-vandsdambrug. Havbrug ved Agersø kan være en kilde til kobber fra imprægne-ring af net og som hjælpestof. PCB’er, dioxin og dioxinlignende PCB’er kan tilfø-res vandmiljøet via fiskefoder. Særligt ved Agersø, hvor skibstrafikken er stor,14

kan tilførslen af organotin, kobber og PAH-forbindelser fra denne kilde være be-tydelig. Vandskiftet og hermed også fortyndingen af tilførte miljøfarlige stoffervurderes at være relativt stor i området.RoskildeOmrådet modtager vand fra renseanlæg bl.a. fra Roskilde by, hvor der er etstørre hospital. Der er ingen klappladser eller havbrug i vandområdet, men om-rådet er tæt på sejlrenden, som løber ind mod Roskilde havn. I oplandet er der,og har været, udledninger fra afværgeboringer ved forurenede industrigrunde.Der er også jordbrugsmarker, hvor overfladeafstrømning kan bidrage med til-førsler. Vandskiftet og hermed også fortyndingen af miljøfarlige stoffer vurderesat være relativt lille i området.FrederiksværkOplandet er kendetegnet ved at have flere renseanlæg bl.a. Frederiksværk ogFrederikssund. I oplandet er der, og har været, udledninger fra en række indu-strier med særskilt udledning bl.a. Dansteel. Der er ingen klappladser eller hav-brug i vandområdet. Vandskiftet og hermed også fortyndingen af tilførte miljø-farlige stoffer vurderes at være middelstor i området.

Sammenhæng mellem tilførsler og koncentrationerKoncentrationer af miljøfarlige stoffer i muslinger, sediment og ålekvabbe, samtvariation over tid ved de tre lokaliteter, er tidligere rapporteret i FORMÅL (Dahl-löf & Strand 2010 a, b).Koncentrationer i muslinger ses ofte som et mål for koncentrationen af miljøfar-lige stoffer i vandsøjlen, som, alt andet lige, afspejler den aktuelle tilførsel af ogbelastning med miljøfarlige stoffer til vandmiljøet. Koncentrationen af kandidat-stofferne i blåmuslinger indikerer, at tilførsel/belastning på de tre lokaliteter i2009 var relativt ens, med undtagelse af PCB, hvor belastningen var markanthøjest ved Frederiksværk.Modsat koncentrationen af miljøfarlige i blåmuslinger vil koncentrationen af mil-jøfarlige stoffer i overfladesediment afspejle tilførsel til og belastningen af lokali-teten over en længere tidsperiode, typisk år til årtier. Dette skyldes, at mangemiljøfarlige stoffer bindes og ophobes i sedimenter dels pga. stoffernes affinitetfor organiske stof og partikler, dels fordi nedbrydningen af miljøfarlige organiskestoffer generelt er langsommere ved reducerede iltforhold i sedimenter. I mod-sætning til blåmuslingedata indikerer resultaterne for tungmetaller, organotin-forbindelserne TBT og DBT, PCB, dioxin og BFR relativt entydigt, at sedimenterved Roskilde og Frederiksværk er markant højere belastet end sedimentet ved15

Ålekvabbens reproduktionscyklusÅlekvabber yngler én gang om året, og kønsmodenhed indtræder i det andetleveår, når fiskene når en længde på 16-17 cm (Vetemaa et al. 1997). Voksneålekvabber kan kønsbestemmes hele året rundt ud fra hannens parringsorgan,som er en forstørret kønspapil, eller i reproduktionsperioden på den forstørredebug hos den drægtige hunålekvabbe.Testiklerne hos ålekvabben er et aflangt, parret organ, som har særligt store cy-lindriske nærings- og støttecelle for sædceller (Sertoli-celler) omkring og eftergydningstidspunktet (Christiansen et al. 2000; Christiansen et al. 1998). Hoshanålekvabber begynder spermatogenesen i december/januar og varer indtiljuli/august, hvor sædrørenes sædvæske er fyldt med modnede sædceller (Chri-stiansen et al. 1998; Kristoffersen & Pekkarinen, 1975). På grund af ålekvab-bers indre befrugtning kan sædcellerne bevæge sig i sædvæsken i modsætningtil forholdene hos fisk med ydre befrugtning (Rasmussen & Korsgaard 2004).Plasmakoncentrationen af det hanlige kønshormon 11-ketotestosteron (og te-stosteron) varierer hen over ynglesæsonen, idet den stiger gennem spermato-genesen (februar-august) og falder drastisk i september (Larsson et al. 2002b).Under spermatogenesen vokser testiklerne, og det gonade-somatiske indeksstiger fra 0,5 % i februar/marts til 2,5 % i august, hvorefter det falder drastisk,efter at gydning har fundet sted (Ronisz et al. 1999; Vetemaa et al. 1997).Hos ålekvabbehunnen omfatter reproduktionscyklus og ægdannelsen (oogene-sen) en intensiv periode i forårs- og sommermånederne, hvor blommematerialeinkorporeres i oocytterne (vitellogenese) (Korsgaard 1994a; Korsgaard & Peter-sen 1979). Efterfølgende kommer ægløsning, befrugtning og drægtighedsperiodefra september til og med februar. I ovariets epitel ligger en reservepulje af tidligeprimære oocytter (0,3 mm), som begynder at modne omkring et år før ægløs-ning i august/september det efterfølgende år (Gotting 1976; Korsgaard 1983;Rasmussen et al. 2002a; Vetemaa et al. 1997). Plasmakoncentrationen af dethunlige kønshormon 17β-østradiol varierer hen over sæsonen, idet den stiger16

fra februar til maj og holder sig relativt lav under drægtigheden (Korsgaard1994a; Larsson et al. 2002a). Under oogenesen og vitellogenesen vokser ova-riet, og det gonade-somatiske indeks stiger markant fra omkring 1 % i maj tilomtrent 30 % lige før fødsel i januar/februar, hvorefter det falder drastisk, efterfødslen har fundet sted (Ronisz et al. 1999; Vetemaa et al. 1997).Udvikling af ungerne i ovarietHos ålekvabben sker ægløsning, parring og befrugtning umiddelbart efter hin-anden sidst i august - tidligt i september (Korsgaard 1986; Korsgaard & Peter-sen 1979; Rasmussen et al. 2006), og processerne foregår synkront i populati-onen (figur2).I nærværende projekt (i 2010) skete befrugtningen i ugen mellem1. og 7. september, mens den i 2011 skete en uge tidligere (upublicerede resul-tater fra SDU).

klækker ca. 3 uger efter befrugtningen (sidst i september) med længder på 8-10mm, og de ligger frit i ovariet omgivet af en såkaldt ovarievæske, hvilket er deneneste forbindelse mellem unger og moderfisk (Korsgaard 1983; Korsgaard &Petersen 1979; Kristofferson et al. 1973).Ungernes blommesækfase varer ca. en måned (oktober), hvor deres vækst ho-vedsagelig er afhængig af den næringsrige blommesæk, men også til dels afnæringsstoffer fra moderfisken (Korsgaard 1986). Det er under denne periode iudviklingen, det så kaldte teratogene vindue, ungerne antages at være mestfølsomme overfor negativ påvirkning.Efter absorptionen af blommesækken og indtil fødslen følger en periode medintensiv vækst, hvor ungernes vækst og udvikling udelukkende afhænger af op-tagelse af næringsstoffer fra moderfisken, dels via ovarievæsken (Korsgaard &Andersen 1985), dels som foreslået af Skov et al. (2010) via embryonernes’dien’ på dievortelignende follikler i ovarievæggen. Ungernes bagtarm er forstørretog specialiseret til at kunne optage.Før klækning samt i en kort periode lige efter klækning er ovariet karakteriseretved store væskefyldte follikler og meget lidt ovarievæske i ovariehulrummet. Efterklækning foregår der et pludseligt skifte i produktionen og fordelingen af væske iovariet. Mængden af ovarievæske i ovariehulrummet øges markant sideløbendemed, at væsken i folliklerne svinder ind (Korsgaard 1986). Ålekvabben har ettæt maternalt-føtalt forhold, idet næringsstoffer (aminosyrer, kulhydrater, lipider),kalcium og ilt, som er essentielle for ungernes vækst og udvikling, transporteresfra moderfiskens blodbane til ovarievæsken, hvor ungerne opholder sig, oghvorfra de indtager deres næring under store dele af deres udvikling i ovariet(Broberg & Kristoffersson 1983; Korsgaard 1983; Korsgaard 1986; Korsgaard1987; Korsgaard 1992; Korsgaard 1994a; Korsgaard 1994b; Korsgaard 1994c;Korsgaard & Andersen 1985; Weber & Hartvig 1984).Ungerne er i stand til både at optage og metabolisere nitrogenholdige nærings-stoffer og inkorporere dem i væv samt udskille dem (Korsgaard 1994a; Kors-gaard 1997). Ungerne optager desuden store mængder kalcium fra ovarievæ-sken til skeletdannelsen (Korsgaard 1994a). Ovariets tilstand og ovarievæskensbiokemiske miljø er derfor meget vigtige for opretholdelse af det normale mater-nelle-føtale forhold og dermed meget vigtige for ungernes almene tilstand(Korsgaard 1994a; Korsgaard 2005; Rasmussen et al. 2002a).Ungernes vækstrate (længde og vægt) er synkron i et kuld og til dels også mel-lem kuld, og i de første måneder er ungernes vækstrate næsten lineær (Kors-

gaard & Andersen 1985; Rasmussen et al. 2006; Vetemaa et al. 1997). Unger-ne bliver født fuldt udviklede og kønsdifferentierede i januar-februar fem til seksmåneder efter befrugtningen. Den naturlige kønsfordeling er 50 % hanner og 50% hunner (Larsson & Forlin 2002; Larsson et al. 2000; Rasmussen et al.2002b).Afhængig af moderfiskens størrelse (længde) fødes 20-200 (maksimalt 400)unger i et kuld (Gotting 1976; Vetemaa et al. 1997), og afhængig af kuldstørrel-sen er ungerne ca. 40-55 mm lange ved fødslen (Rasmussen et al. 2006). Deer mere glasklare, men ellers ligner de den voksne fisk. Under normale omstæn-digheder dør nogle få procent af de nyudklækkede embryoner, hvorimod døde-ligheden i senere udviklingsstadier er meget lav (Jacobsson et al. 1986).

Misdannelser i danske ålekvabber 2004-2010Fejludviklede unger hos ålekvabbeunger kan inddeles i 10 forskellige typer sombeskrevet i den tekniske anvisning for NOVANA (Strand & Dahllöf 2005) (tabel1).Tabel 1. Karakterisering af forskellige typer af fejludviklede unger i kuld fra ålekvabbe(efter Strand & Dahllöf 2005).0ABCDEFGHIBefrugtede æg eller embryoner, der lige er klækket (< 10 mm)Døde unger uden misdannelser (> 10 mm)Unger med misdannelser i blommesæk eller indvoldeUnger med ’vinkelknæk’ på rygradUnger med spiralformet rygradUnger med defekt på øjne eller manglende øjneUnger med misdannelser i hovedetTo sammenvoksede unger, eventuelt som siamesiske tvillingerAndre abnormiteter, evt. som kalcificerede unger eller sammenfiltrede klyngerSignifikant mindre unger, ’dværgvækst’

Forekomsten af misdannelser i kuld fra ålekvabber er efter en indledende un-dersøgelse i 2001-2002 (Strand et al. 2004) blevet undersøgt årligt i perioden2004-2010 i en række danske kystnære områder som en del af det nationaleovervågningsprogram for vandmiljø og natur (NOVANA). Undersøgelserne haromfattet de tre undersøgelsesområder, som indgår i FORMÅL-projektet: Agersøi Storebælt og Roskilde Fjord ved Roskilde Bredning samt ved Frederiksværk.Det mindst belastede område ved Agersø har gennemgående en lavere andelaf kuld med misdannelser end områderne ved Roskilde og Frederiksværk. VedAgersø har generelt < 5 % af kuldene en forhøjet forekomst af misdannelser aftype B-G, hvorimod disse misdannelser findes i > 5 % af kuldene ved Roskildeog Frederiksværk. Der er også en væsentlig år til år variation i forekomsten afmisdannelser, hvor niveauerne i Roskilde og Frederiksværk er blevet lavere i deseneste år (figur3).

Til forskel fra Roskilde og Frederiksværk er der i de seneste år observeret enstigning i niveauerne af misdannelser i NOVANA-området ved Karrebæk Fjord.Fordelingen af de enkelte typer af deformiteter af type B-G gennem årene giveret uddybet billede af variation inden for og mellem områder (figur4).Der er større år til år variationer i typefordeling ved Frederiksværk end i Roskilde,og specielt øjenskade varierer kraftigt ved Frederiksværk. I starten af undersø-gelserne var andelen af øjenskader stor, mens de ikke var til stede i 2007 ogefterfølgende har udgjort en lavere andel. I Roskilde er typefordelingen mereens over tid, og til forskel fra Frederiksværk findes der oftere siamesiske tvillinger.De samme overordnede tendenser som for type B-G gør sig gældende for an-delen af kuld med en øget forekomst af totalt abnorme unger (dvs. > 10 % afbåde tidligt og sent døde unger, misdannede unger og dværge) (figur5).

Misdannelser i danske ålekvabber i et internationalt perspektivÅlekvabbe er i en årrække blevet anvendt som indikatorart for både biologiskeeffekter og miljøfarlige stoffer i fisk i forbindelse med regionale og nationaleovervågningsaktiviteter i flere af vores nabolande omkring Østersøen, herunderTyskland og Sverige (Hedman et al. 2011). Ligesom i de danske undersøgelserunder NOVANA-programmet er forhøjede frekvenser af misdannelser i kuld fraålekvabbe i Sverige og Tyskland især fundet i områder tæt på byer og industri(bl.a. Vetema et al. 1997; Gercken et al. 2006). I flere af disse undersøgelser erder udover misdannelser også observeret en øget forekomst af fejludviklingsom tidligt og sent døde unger hos ålekvabbe. En russisk undersøgelse har og-så i de voksne ålekvabber fundet flere misdannelser i områder, som anses sommere belastede (Yershov 2008).I 2009 er der ligesom i Danmark udført undersøgelser i både Tyskland og Sve-rige. Resultaterne er blevet sammenstillet indenfor BONUS+-projektet BALCO-FISH.Der er betydelige geografiske forskelle i forekomsten af kuld med en øget andelaf misdannelser af type B-G (figur6).De højeste niveauer findes i KarrebækFjord efterfulgt af stationer ved den tyske Østersøkyst, den mest indelukkedestation på den svenske østkyst samt Roskilde og Frederiksværk. De laveste ni-veauer forekommer ved Agersø samt i områder på den svenske vest og øst-kyst.

Biomarkører i forhold til miljøfarlige stoffer og misdannelserBiomarkører forventes at kunne fortælle om eksponering for stoffer, men ogsåom ålekvabbens fysiologiske tilstand. CYP1A-aktivitet er brugt som et mål foreksponering for organiske stoffer, som inducerer produktion af CYP1A-enzymet, fx PAH’er og dioxiner.Der er en sammenhæng mellem CYP1A-aktivitet og PAH-metabolitter i august,dog med forbehold for at datagrundlaget er begrænset (figur8a).Denne sam-menhæng ses dog ikke i november (figur8b).Derimod er der en indikation af,at CYP1A-aktiviteten i november nogenlunde svarer til PAH-metabolitter i au-gust – dog igen baseret på et begrænset datagrundlag.

Når ålekvabber bliver eksponeret for olie ved injektion, går der tre dage indenniveauerne af CYP1A-enzymet er forskellige fra kontroller (Celander et al.1994). Enzymniveauet forblev på det forhøjede niveau 14 dage efter ekspone-ring, hvor forsøget blev afsluttet (Celander et al. 1994). Der er også rapporteretenzymstabilitet i 28 dage i andre fisk (Zapata-Pérez 2002). På baggrund af det-te kan det være rimeligt at antage, at niveauer målt i november svarer til ekspo-nering langt tidligere. Det kræver dog flere feltdata, inden denne sammenhængkan etableres med sikkerhed.

Sammenhæng mellem miljøfarlige stoffer og misdannelserI eksponeringsforsøget, hvor ålekvabbehunner blev injiceret med enkeltstoffereller blandinger (Tabel 2), fandtes ikke direkte additive effekter, når eksponeringfor såvel enkeltstoffer som blandinger blev inkluderet (Brande-Lavridsen et al.2011). Effekter af pyren og dioxin (TCDD) var fx på størrelse med eller størreend effekterne, hvor disse stoffer indgik i blandinger i de samme koncentratio-ner. Endvidere svarede effekterne af blandingen Dk10 omtrent til effekt af kunpyren ved lavere koncentrationer.Tabel 2. Forsøgsgrupper og eksponeringsniveau af stoffer.GruppeKontrolDk10Dk50Dk50+Dk+TBTPyrenTCDDCu5 ng Sn-TBT + 200 ng pyren + 10 pgTCDD25 ng Sn-TBT + 1 �g pyren + 50 pg TCDD25 ng Sn-TBT + 1 �g pyren + 50 pg TCDD +500 ng NP + 2,5 ng BFR + 500 ng PFOS500 ng NP + 2,5 ng BFR + 500 ng PFOS25 ng Sn-TBT1 �g pyren50 pg TCDD1 �g CuEksponering(per g vådvægt hun)

En årsag til mangel på simple sammenhænge kan være, at der er interaktion,når stofferne forekommer i blandinger. De stoffer, som blev brugt i forsøget, til-hører forskellige kemiske stofgrupper, men påvirker mange af de samme en-zymsystemer i cellerne. Dette betyder, at når stoffer forekommer i blandinger,kan effekten af det ene modvirkes af et andet. At kvantificere disse interaktionerkræver en forsøgsopstilling, som er mere kompleks end den, der blev benyttet idenne undersøgelse.Derimod var der sammenhæng mellem effekter af tre af blandingerne, som ind-gik i forsøget. Effekterne, andel misdannelser af type B-G, af den blanding, somindeholdt 6 stoffer (Dk50+), var en sum af effekterne af blandingerne Dk50 og

Dk+, som hver indeholdt tre af stofferne (se tabel 1 i Brande-Lavridsen et al.2011).Denne sammenhæng er her undersøgt yderligere ved brug af multivariat reg-ression (PLS - partial least square,Dayal et al. 1997)ved at konstruere model-ler for, hvordan koncentrationen af de forskellige stoffer i æg og unger kan for-klare andelen af misdannelser af type B-G og andelen af totalt abnorm yngel.Stabiliteten af modellen vurderes ved brug af kryds-validering (Wold 1978) ogsignifikante x-variabler vurderes ved Martens usikkerhedstest (Martens & Mar-tens 2000). Modellerne er efterfølgende brugt til at forudsige (prædiktere) ande-len af misdannelser i Agersø, Roskilde og Frederiksværk, baseret på data formiljøfarlige stoffer i æg og unger indsamlet i 2009 (Dahllöf et al. 2010a).Til mo-delleringen blev softwaren Unscramble version X (www.camo.no) benyttet.Forudsætninger for modelleringenI multivariat-modellering er det en forudsætning, at der er adgang til et størredatasæt med mange prøver (mindst 4) og x-variabler. Da de modeller, vi herkan konstruere, indeholder det lavest anvendelige antal prøver, skal resultaternefortolkes med forsigtighed. Modelleringen giver dog en mulighed for at øge for-ståelsen af sammenhæng mellem miljøfarlige stoffer og misdannelser.Koncentrationer af miljøfarlige stoffer i æg og unger fra forsøget (x-variabler imodellerne) blev kun målt på Dk50+ og kontrolgrupperne. Koncentrationer afstoffer i Dk+ er derfor sat til de målte koncentrationer af PFOS, BFR og nonyl-phenol i Dk50+, samt koncentrationerne for TBT, TCDD og PAH fra kontrolfisk.På tilsvarende måde er der til Dk50 brugt koncentrationer af stofferne TBT,TCDD og PAH målt i Dk50+, og koncentrationerne af PFOS, BFR og nonylphenoler fra kontrol. PAH-metabolitter i galde fra hunner i august respektive novemberblev brugt som proxy for pyreneksponering. Eftersom PFOS, BDE-47 og TBT iforsøget blev brugt som modelstoffer for eksponering af grupperne perfluorere-de stoffer, bromerede flammehæmmere, og summen af organotinforbindelsernetributyltin (TBT) og triphenyltin (TPhT) er koncentrationer fra feltstudiet gruppe-ret på tilsvarende måde. Tilsvarende blev toksiske ækvivalenter (TEQ) brugtsom samlet vurdering af eksponering for dioxiner og dioxinlignende PCB’er. No-nylphenol indgik desværre ikke i modellerne, da der ikke fandtes data for stoffetfra feltstudier.Effekterne (y-variabler i modellerne) er angivet som % af hunner med > 5 % typeB-G-misdannelser i kuld eller som % af hunner med > 10 % totalt abnorme ungeri kuld.

Sammenhæng mellem eksponering målt i æg og misdannelserI modellerne af sammenhæng mellem koncentrationer af miljøfarlige stoffer iæg og misdannelser bruges som udgangspunkt de kemiske målinger for orga-notin (OT), bromerede flammehæmmere (BFR), perfluorerede forbindelser(PFAS) samt pyren (x-variabler). Dioxin TEQ og nonylphenol er udeladt fra mo-dellen, da der ikke findes data for æg fra Agersø og Frederiksværk.Der kunne etableres en signifikant model for misdannelser af type B-G (figur9a)og eksponering i æg ved brug af to faktorer. Samtlige x-variabler bidrog signifi-kant til modellen, hvor BFR og PFAS bidrog mest til den første faktor, men medbidrag fra organotin (OT) og pyren. Organotin og pyren dominerede faktor 2,hvor BFR og PFAS påvirkede negativt (figur9b).

Det blev også undersøgt, om nogle af stofferne kunne udelades fra modellen ogderved forbedre forudsigelsen, men det var ikke tilfældet. Modellerne baseretpå forsøget blev stærke, men de prædikterede niveauer blev konsekvent over-estimerede (data ikke vist). Resultatet fra modelleringen understøtter derfor an-tagelsen om, at der er interaktion mellem de forskellige stofgrupper, selv omdisse interaktioner ikke direkte kan udledes fra modellen.Desuden tyder afprøvningen af variationer af modellen på, at der ikke kan ud-peges én stofgruppe som hovedansvarlig eller som uvedkommende for effek-terne, men at det er den samlede påvirkning af mange stofgrupper, som er afbetydning. Derved er det også forståeligt, at de fire stofgrupper, som indgik, ikkeer nok til fuldkommen at forklare effekterne i miljøet, og at usikkerhederne eromfattende.Den eneste af de to andre enkelt-typer af misdannelser, type 0 og I, som resul-terede i en signifikant model, var type 0, hvor pyren og TBT var de eneste fakto-rer, som havde indflydelse. Men modellen var svag og prædikteringen af mis-dannelser i felten gav meget store usikkerheder.Derimod var det muligt at etablere en sammenhæng mellem andel kuld medabnorme unger (> 10 %), hvor type 0, I og B-G er slået sammen, og målinger iæg. I dette tilfælde er modellen også signifikant, men mindre stærk (figur11a),og indflydelsen af de signifikante variabler afspejler (figur11b)en kombinationaf modellen for type B-G og type 0.

te (PFAS og BFR), har større indflydelse på type B-G end på type I og 0. Om-vendt har organotin og pyren større betydning for type I og 0. Organotin ogPAH’er har en højere akut toksicitet end PFAS og BFR, hvilket kan forklare de-res større bidrag til type 0 (tidligt døde unger). Det bør også bemærkes, at Ste-nungsund, som er domineret af petrokemiske kilder, var den af de svenske lo-kaliteter, som i 2009 havde størst forskel mellem type B-G og totalt abnormeunger.Sammenhæng mellem eksponering målt i unger og misdannelserPå tilsvarende måde som for æg blev der, baseret på målinger i unger, lavetmodeller, som inkluderede TEQ. De stofgrupper, som kom ud som signifikante,var forskellige fra modellerne baseret på æg (figur13),hvilket kan skyldes, atflere stofgrupper var med fra starten, men også at indholdet i unger er et resultataf optag og metabolisering igennem de to måneder efter eksponering.

Denne overestimering viser, at de observerede effekter i ringere grad kan til-skrives indholdet af miljøfarlige stoffer i unger end indholdet i æg. Dette er ioverensstemmelse med, at det teratogene vindue, dvs. den mest følsomme pe-riode i udviklingen af unger, er i den tidlige udviklingsfase. At modellerne baseretpå eksperimentet alligevel blev signifikante skyldes formentligt, at alle hunnerblev eksponerede én gang på det samme tidspunkt, og med ens blandinger.Det betyder, at der er entydig sammenhæng mellem eksponering i æg og deresulterende koncentrationer i ungerne i forsøget. Denne sammenhæng kan ikkeforventes i felten, hvor der mellem hunner dels er større variation i tidspunkt forog størrelse af eksponering helt fra starten af den reproduktive periode, menogså en kontinuerlig eksponering gennem efteråret.For at styrke en fremtidig forståelse af sammenhæng mellem eksponering forforskellige stofgrupper og misdannelser, vil det være bedre at måle miljøfarligestoffer i august end i november. Indsamling af et tilstrækkeligt antal hunner til atopnå nok prøvemateriale i form af æg betyder dog en større reduktion af popu-lationen af reproduktive hunner. Et alternativ kunne være at måle miljøfarligestoffer i muskler. For at afprøve dette blev indhold af miljøfarlige stoffer i muskelfra ålekvabbehunner og i æg målt i 2009 sammenlignet i en multivariat analyse(PCA).Sammensætningen af miljøfarlige stoffer i æg fra Roskilde ligner mere indholdeti hunner fra august end fra november, hvilket også er tilfældet for Agersø, menforskellen er mindre (figur15).For Frederiksværk derimod, er sammensætnin-gen i muskler næsten ens i august og november. Det skal dog bemærkes, atder indgår flere analyser for Roskilde end for Agersø og Frederiksværk, idet di-33

Selv om koncentrationerne i hunner i august ligner indholdet i æg, er der ikkehelt sammenfald. For Roskilde, hvor flere stoffer indgår i analysen, er dette mesttydeligt. Dette skyldes formentlig, at koncentrationer i hunner varierer meget,idet stofferne fjernes fra hunnen og overføres til æg under hele vitellogenesenfra det sene forår og gennem sommeren. Derfor angiver anbefalinger til rumligog tidsmæssig monitering af miljøfarlige stoffer i fisk som ålekvabbe i Østersø-regionen, fx HELCOM-COMBINE (HELCOM 2006), at belastningsgraden målesi hanner, da de ikke udskiller de miljøfarlige stoffer i samme grad som hunner iforbindelse med deres reproduktion.

KonklusionerDer er interaktioner mellem stoffer i blandinger, såvel forstærkende somhæmmende, og derfor kan kombinationseffekter ikke udledes fra forsøgkun med enkeltstoffer.En stærkere sammenhæng mellem misdannelser i ålekvabbeunger ogbelastning med miljøfarlige stoffer i æg end i unger peger på, at det ereksponering i det såkaldte teratogene vindue i starten af embryoudvik-lingen, som er af størst betydning.Stoffer, som er mere akuttoksiske, fx organotin og PAH’er, ser ud til athave større betydning for udvikling af tidligt døde unger.Stoffer, som ikke er så akuttoksiske, fx bromerede flammehæmmere ogperfluorerede stoffer, bidrager i større udstrækning til deformiteter af ty-pe B-G end til tidligt døde unger.De store variationer i misdannelser mellem år kan skyldes, at også til-førsler af miljøfarlige stoffer varierer fra år til år. Variationer i tilførselfanges til dels af overvågningen af miljøfarlige stoffer i biota i november,men kan ikke forventes helt at dække den for ålekvabben vigtigste peri-ode.På grund af de rumlige og tidsmæssige variationer i forekomst af mis-dannelser, samt at forholdet mellem type B-G og totalt abnorme ungervarierer, tyder det på at det er de lokale tilførsler af miljøfarlige stofferog ikke mere overordnede forskelle i miljøforhold fra år til år som er afbetydning.Overførslen af miljøfarlige stoffer fra mor til æg og derved afkommet fin-der sted dels forud for det teratogene vindue i forbindelse med vitello-genese og dannelsen af æg, dels senere i udviklingsperioden, når un-gerne begynder at optage næringsstoffer aktivt fra ovarievæsken.

AnbefalingerDet anbefales, at der gennemføres forsøg, som afklarer betydningen afeksponeringen under det teratogene vindue inden befrugtning af åle-kvabbehunner. Denne eksponering kan foregå gennem føden, hvilketogså gør det muligt at undersøge interaktioner mellem metaller og or-ganiske miljøfarlige stoffer.For at styrke forståelsen af sammenhængen mellem belastning og mis-dannelser hos ålekvabber, og som supplement til målinger i f.eks. over-vågningssammenhæng anbefales det, at belastninger analyseres ihanner. En samtidig sammenligning mellem belastning i hanner oghunner vil også direkte styrke brugen af resultaterne fra dette projekt.35

Brande-Lavridsen, N., Bjerregaard, P., Korsgaard, B., Strand, J., Dahllöf, I.,2011, Eksponeringsforsøg med ålekvabbe, NST.Broberg. S. & Kristoffersson, R. 1983: Oxygen-Consumption and Lactate Ac-cumulation in the Intra-Ovarian Embryos and Young of the Viviparous Fish,Zoarces viviparus(L) in Relation to Decreasing Water O-2 Concentration. -Annales Zoologici Fennici 20: 301-306.Celander, M., Nät, C., Broman, D. & Förlin, L. 1994: Temporal aspects of induc-tion of hepatic cytochrome P4501A and conjugating enzymes in the vivipa-rous blenny (Zoarcesviviparus)treated with petroleum hydrocarbons. -Aquatic Toxicology 29: 183-196.Christiansen, T., Kinnberg, K., Bjerregaard, P. & Korsgaard, B. 2000: gamma-Glutamyl transpeptidase as a possible marker of Sertoli cells in fish testesfor studies of xenoestrogens. - Marine Environmental Research 50: 213-216.Christiansen, T., Korsgaard, B. & Jespersen, A. 1998: Effects of nonylphenoland 17 beta-oestradiol on vitellogenin synthesis, testicular structure and cy-tology in male eelpoutZoarces viviparus.- The Journal of Experimental Biol-ogy 201: 179-192.Dahllöf, I. & Strand, J. 2010a: Miljøfarlige stoffer i ålekvabbe – Delrapport I. -Naturstyrelsen, www.nst.dk, ISBN: 978-87-92708-21-2.Dahllöf, I. & Strand, J. 2010b: Miljøfarlige stoffer i sediment of muslinger – Del-rapport III. Naturstyrelsen, www.nst.dk, ISBN: 978-87-92708-23-6.Dayal, B.S. & MacGregor, J.F. 1997: Improved PLS Algorithms. - Journal ofChemometrics 11: 73-85.Gercken, J., Förlin, L. & Andersson, J. 2006: Developmental disorders in larvaeof eelpout (Zoarcesviviparus)from German and Swedish Baltic coastal wa-ters. - Marine Pollution Bulletin 53: 497-507.Gotting, K.J. 1976: Reproduction and Oocyte-Development inZoarces viviparus(Pisces, Osteichthyes). - Helgolander Wissenschaftliche Meeresunter-suchungen 28: 71-89.Halling-Sørensen, B., Petersen, G., Stuer-Lauridsen, F., Slothuus, T., Kinnberg,K. & Bjerregaard, P. 2008: Kemiske stoffer der kan føre til misdannelser ifisk. Indkredsning af stoffer ud fra deres biokemiske virkemekanisme. Rap-port fra By- og Landskabsstyrelsen. 112 s.http://www2.blst.dk/udgiv/Publikationer/2008/978-87-92256-41-6/pdf/978-87-92256-42-3.pdf

Jacobsson, A., Neuman, E. & Thoresson, G. 1986: The Viviparous Blenny asan Indicator of Environmental Effects of Harmful Substances. - Ambio 15:236-238.Korsgaard, B. 1983: The Chemical-Composition of Follicular and Ovarian Fluidsof the Pregnant Blenny (Zoarcesviviparus(L)). - Canadian Journal of Zoology- Revue Canadienne de Zoologie 61: 1101-1108.Korsgaard, B. 1986: Trophic adaptations during early intraovarian development ofembryos ofZoarces viviparus(L.) - Journal of Experimental Marine Biologyand Ecology 98: 141-152.Korsgaard, B. 1987: Assimilation and metabolism of exogenous glucose byyolk-sac embryos after intraovarian preincubation and in vitro inZoarces vi-viparus.-Canadian Journal of Zoology - Revue Canadienne de Zoologie 65:1201-1205.Korsgaard, B. 1992: Amino Acid Uptake and Metabolism by Embryos of theBlenny Zoarces Viviparus. - The Journal of Experimental Biology 171: 315-328.Korsgaard, B. 1994a: Calcium-Metabolism in Relation to Ovarian FunctionsDuring Early and Late Pregnancy in the Viviparous BlennyZoarces vivipa-rus.- Journal of Fish Biology 44: 661-672.Korsgaard, B. 1994b: Nitrogen distribution and excretion during embryonic post-yolk sac development inZoarces viviparus.- Journal of Comparative Physi-ology B: Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology 164: 42-46.Korsgaard, B., 1994c. Proteins and Amino-Acids in Maternal-Embryonic TrophicRelationships in Viviparous Teleost Fishes. Isr.J.Zool. 40, 417-429.Korsgaard, B., 1997. Ammonia and urea in the maternal-fetal trophic relation-ship of the viviparous blenny (eelpout) Zoarces viviparus. Physiol.Zool. 70,712-717.

Korsgaard, B., Andersen, F.O., 1985. Embryonic Nutrition, Growth and Energet-ics in Zoarces-Viviparus l As Indication of A Maternal-Fetal Trophic Rela-tionship. Journal of Comparative Physiology B-Biochemical Systemic andEnvironmental Physiology 155, 437-444.Korsgaard, B., Petersen, I., 1979. Vitellogenin, Lipid and Carbohydrate-Metabolism During Vitellogenesis and Pregnancy, and After Hormonal In-duction in the Blenny Zoarces viviparus (L). Comparative Biochemistry andPhysiology B-Biochemistry & Molecular Biology 63, 245-251.Kristofferson, R., Broberg, S., Pekkarinen, M., 1973. Histology and physiologyof embryotrophe formation, embryonic nutrition and growth in the eelpoutZoarces viviparus (L.). Ann.Zool.Fennici 10, 467-477.Larsson, D.G.J., Forlin, L., 2002. Male-biased sex ratios of fish embryos near apulp mill: Temporary recovery after a short-term shutdown. Environ.HealthPerspect. 110, 739-742.Larsson, D.G.J., Hallman, H., Forlin, L., 2000. More male fish embryos near apulp mill. Environ.Toxicol.Chem. 19, 2911-2917.Larsson, D.G.J., Mayer, I., Hyllner, S.J., Forlin, L., 2002a. Seasonal variationsof vitelline envelope proteins, vitellogenin, and sex steroids in male and fe-male eelpout (Zoarces viviparus). Gen.Comp.Endocrinol. 125, 184-196.Larsson, D.G.J., Mayer, I., Hyllner, S.J., Forlin, L., 2002b. Seasonal variationsof vitelline envelope proteins, vitellogenin, and sex steroids in male and fe-male eelpout (Zoarces viviparus). Gen.Comp.Endocrinol. 125, 184-196.Martens, H. & Martens, M. 2000: Modified Jack-knife estimation of parameter un-certainty in bilinear modelling by partial least squares regression (PLSR). -Food Quality and Preference 11: 5-16.Rasmussen, T.H., Andreassen, T.K., Pedersen, S.N., Van der Ven, L.T.M.,Bjerregaard, P., Korsgaard, B., 2002a. Effects of waterborne exposure ofoctylphenol and oestrogen on pregnant viviparous eelpout (Zoarces vivipa-rus) and her embryos in ovario. J.Exp.Biol. 205, 3857-3876.Rasmussen, T.H., Andreassen, T.K., Pedersen, S.N., Van der Ven, L.T.M.,Bjerregaard, P., Korsgaard, B., 2002b. Effects of waterborne exposure ofoctylphenol and oestrogen on pregnant viviparous eelpout (Zoarces vivipa-rus) and her embryos in ovario. J.Exp.Biol. 205, 3857-3876.Rasmussen, T.H., Jespersen, A., Korsgaard, B., 2006. Gonadal morphogenesisand sex differentiation in intraovarian embryos of the viviparous fishZoarces viviparus (Teleostei, Perciformes, Zoarcidae): A histological and ul-trastructural study. J.Morphol. 267, 1032-1047.

Rasmussen, T.H., Korsgaard, B., 2004. Estrogenic octylphenol affects seminalfluid production and its biochemical composition of eelpout (Zoarces vivipa-rus). Comp.Biochem.Physiol.C 139, 1-10.Ronisz, D., Larsson, D.G.J., Forlin, L., 1999. Seasonal variations in the activi-ties of selected hepatic biotransformation and antioxidant enzymes in eel-pout (Zoarces viviparus). Comparative Biochemistry and Physiology C-Pharmacology Toxicology & Endocrinology 124, 271-279.Skov, P.V., Steffensen, J.F., Sorensen, T.F., Qvortrup, K., 2010. Embryonicsuckling and maternal specializations in the live-bearing teleost Zoarces vi-viparus. J.Exp.Mar.Biol.Ecol. 395, 120-127.Strand, J., Andersen, L., Dahllöf, I. & Korsgaard, B. 2004: Impaired larval devel-opment in broods of eelpout (Zoarcesviviparus)in Danish coastal waters. -Fish Physiology and Biochemistry 30: 37-46.Strand & Dahllöf 2010 Biomarkører i ålekvabbe – Delrapport II. Naturstyrelsen,www.nst.dk, ISBN: 978-87-92708-22-9Stuer-Lauridsen, F., Gustavson, K., Møhlenberg, F., Dahllöf, I., Strand, J., Bjer-regaard, P., Korsgaard, B., Rasmussen, T.H. & Halling-Sørensen, B. 2008:Misdannet ålekvabbeyngel og andre biologiske effekter i danske vandområ-der. Litteraturudredning. Miljøministeriet, By- og Landskabsstyrelsen. 208 s.http://www2.blst.dk/udgiv/Publikationer/2008/978-87-7052-384-4/html/default.htm

Vetemaa, M., Förlin, L. & Sandström, O. 1997: Chemical industry effluent im-pacts on reproduction and biochemistry in a North Sea population of vivipa-rous blenny (Zoarcesviviparus).- Journal of Aquatic Ecosystems Stressand Recovery 6: 33-41.Weber, R.E., Hartvig, M., 1984. Specific Fetal Hemoglobin Underlies the Fetal-Maternal Shift in Blood-Oxygen Affinity in A Viviparous Teleost. MolecularPhysiology 6, 27-32.Wold, S. 1978: Cross-validatory estimation of the num-ber of components in factor and principal components models. - Tech-nometrics 20(4): 397-405.Zapata-Pérez, O., Gold-Bouchot, G., Ortega, A. López, T. & Albores, A., 2002:Effect of Pyrene on Hepatic Cytochrome P450 1A (CYP1A) Expression inNile Tilapia (Oreochromisniloticus).- Archives of Environmental Contami-nation and Toxicology 42: 477-485.Yershov, P.N. 2008: The vertebral abnormalities in eelpoutZoarces viviparus(Linnaeus, 1758) (Pisces, Zoarcidae). - Proceedings of the Zoological Insti-tute RAS 312(1/2): 74-82.