MIU, Alm.del - 2011-12 - Bilag 150: Undersøgelsesrapporter vedr. misdannede ålekvabefisk, fra miljøministeren

Resume:Ansvarlig institution:DCE - Nationalt Centre for Miljø ogEnergi, Aarhus Universitet og SyddanskUniversitetCopyright:Må citeres med kildeangivelser.Naturstyrelsen, MiljøministerietNaturstyrelsen vil, når lejligheden gives,Forfattere:Nanna Brande-Lavridsen, Poul Bjerre-gaard & Bodil Korsgaard, SyddanskUniversitet. Jakob Strand & IngelaDahllöf, Aarhus Universitet, Institut forBioscienceAndre bidragydereBirgit Søborg, Zhanna Tairova, GitteJakobsen, Jette Porsgaard, Anette BirkVorup, Kim Gustavson.Sprog:DanskÅr:2011offentliggøre rapporter og indlæg ved-rørende forsknings- og udviklingspro-jekter inden for miljøsektoren, finansie-ret af Naturstyrelsen. Det skal bemær-kes, at en sådan offentliggørelse ikkenødvendigvis betyder, at det pågæl-dende indlæg giver udtryk for Natursty-relsens synspunkter. Offentliggørelsenbetyder imidlertid, at Naturstyrelsen fin-der, at indholdet udgør et væsentligtindlæg i debatten omkring den danskemiljøpolitik.Laboratorieforsøg viser, at visse miljø-realistiske blandinger af miljøfarligestoffer, og enkeltstoffer, har en tendenstil at forøge andelen af misdannede un-ger i ålekvabber. En simpel dosis-respons sammenhæng kan dog ikkeudledes.

Forord ............................................................................................................ 5Sammenfatning............................................................................................. 7Summary ....................................................................................................... 9Introduktion................................................................................................. 11Kandidatstoffer og doser........................................................................... 11Biomarkører og optagelse/metabolisme af organismefremmede stoffer.. 14Metoder og prøvetagning .......................................................................... 17Indsamling................................................................................................. 17Kemikalier og blandinger .......................................................................... 17Forsøgsopstilling....................................................................................... 18Undersøgelse af voksne fisk og unger ..................................................... 19Databehandling og statistik....................................................................... 22Resultater .................................................................................................... 25Eksponering af æg og unger..................................................................... 25Overførsel fra moder til æg og unger........................................................ 29Biometri og kondition ................................................................................ 30Misdannelser i unger................................................................................. 32Øvrige biomarkører ................................................................................... 35Diskussion................................................................................................... 37Eksponering .............................................................................................. 37Misdannelser og abnorm udvikling af unger ............................................. 37Sammenhæng mellem eksponering og effekter ....................................... 39Konklusioner og anbefalinger................................................................... 43Referencer ................................................................................................... 45

I forbindelse med den nationale overvågning af vandmiljøet (NOVANA) i årene2004-2008 er der fundet forhøjede forekomster af misdannede unger i kuld frafisken ålekvabbe i en række danske fjorde. I andre lande, herunder Tyskland ogSverige, er der gjort lignende fund af misdannede ålekvabbeunger.Der er tidligere blevet gennemført to litteraturstudier i Miljøministeriets regi: 1)Misdannet ålekvabbeunger og andre biologiske effekter i danske vandområder.Litteraturudredning (Stuer-Lauridsen et al. 2008), og 2) Kemiske stoffer der kanføre til misdannelser i fisk. Indkredsning af stoffer ud fra deres biokemiske vir-kemekanisme (Halling-Sørensen et al. 2008).Konklusionerne fra disse udredninger var, at ålekvabbeunger med misdannelserer hyppigst forekommende i kystnære områder med menneskelig aktivitet, og atder er mistanke om, at fx klorerede organiske forbindelser, TBT, PAH, pestici-der, tungmetaller, lægemidler og stoffer med hormonforstyrrende effekter er år-sagen til fund af misdannelser, evt. ved additiv virkning fra flere stoffer.FORMÅL-projektet (’Et undersøgelsesforløb til atFORklarefund afMisdannedeÅLekvabbeungeri danske fjorde’) er en del af Miljøministeriets tilvejebringelseaf viden, der er nødvendig, for at Naturstyrelsen kan opstille forslag til indsatser,der kan imødegå biologiske effekter i miljøet.FORMÅL-projektet består af tre trin:1. Et måleprogram, der kan tilvejebringe et fyldestgørende billede af vandmil-jøets tilstand med hensyn til miljøfarlige stoffer for at indkredse årsagen tilfund af misdannelser i ålekvabbeunger.2. Laboratorieforsøg til etablering af viden om effektniveauer for udvalgte ke-miske stoffer i ålekvabber.3. En tværgående analyse af de gennemførte aktiviteter og resultater fra an-dre projekter, der sammenfatter viden om årsager til forekomst og udbre-delse af effekter og misdannelser i ålekvabber.De overordnede resultater og konklusioner fra trin 1 er sammenfattet i ’Miljøfar-lige stoffer og ålekvabbe – et feltstudie. FORMÅL - Trin 1 ud fra 3 delrapporter:I) Miljøfarlige stoffer i ålekvabbe, II) Biomarkører i ålekvabbe samt III) Miljøfarli-ge stoffer i sediment og muslinger.Denne rapport omhandler resultaterne fra trin 2, hvor formålet var at undersøge,om den indikerede kausale sammenhæng mellem udsættelse for miljøfarligestoffer og misdannelser i ålekvabbeunger kunne eftervises i laboratorieforsøg.

Projektet FORMÅL (”Et undersøgelsesforløb til atFORklarefund afMisdannedeÅLekvabbeungeri danske fjorde”) er fase 3 i Naturstyrelsens undersøgelsesfor-løb iværksat for at klargøre et eventuelt sammenhæng mellem miljøfarlige stof-fer og misdannelser i fisken ålekvabbe (Zoarcesviviparus).FORMÅL indeholdertre trin, hvor det første er et feltbaseret måleprogram, som vurderer vandmiljøetsog ålekvabbens tilstand med hensyn til miljøfarlige stoffer. En sammenfatning afresultaterne af første trin findes i: ’Miljøfarlige stoffer og ålekvabbe – et feltstu-die. FORMÅL - Trin 1’. Trin 2 er laboratoriebaserede eksperimenter med åle-kvabber og relevante kandidatstoffer og trin 3 er en integreret analyse baseretpå resultaterne af trin 1 og 2 af FORMÅL samt resultater fra andre relevanteprojekter om ålekvabber.Litteraturstudier i de tidligere to faser har peget på, at bl.a. tungmetaller, orga-notin, tjærestoffer (PAH’er), klorerede aromatiske stoffer som fx dioxin og dio-xinlignende PCB’er og bromerede flammehæmmere er de mest sandsynlige år-sager til misdannelser i fisk. Disse miljøfarlige stoffer samt blødgørere (phthalater)og perfluorerede stoffer (PFAS) blev målt i æg, muskel og lever hos ålekvabbe-hunner og -unger indfanget i et feltstudie på tre forskellige lokaliteter. Stærkekandidatstoffer blev udpeget på baggrund af kraftigt forhøjede koncentrationer iålekvabber fra to lokaliteter ved Roskilde og Frederiksværk, hvor mere end 5 %af kuldene havde mere end 5 % deformiteter, i forhold til Agersø, hvor der ikkeer fundet tilsvarende forhøjede niveauer af misdannede unger hos ålekvabbe.For at verificere at de stærke kandidatstoffer kan være årsag til misdannelser iålekvabbeunger, gennemførtes et kontrolleret eksponeringsforsøg med de stærkekandidatstoffer i blandinger og som enkeltstoffer i relevante doser. Denne rap-port omhandler disse eksponeringsforsøg.Forekomst af miljøfarlige stoffer blev målt i æg fra én af eksponeringerne, samt ikontrolfisk, tre dage efter eksponering og i unger sidst i forsøget. Unger fra kon-trol og de eksponerede ålekvabbehunner blev undersøgt for forekomst af mis-dannelser, samt for biometriske mål til vurdering af kondition. I hunner blev dermålt for CYP1A-aktivitet i lever, og for kalciumindhold i plasma og ovarievæske.PAH-metabolitter blev også målt i hunner som et mål for PAH-eksponering. Der-udover blev hunners biometriske mål brugt til at beregne forskellige konditions-indeks.Undersøgelsen viste, at visse miljørealistiske blandinger af miljøfarlige stoffereller enkeltstoffer har en tendens til at forøge andelen af misdannede unger iålekvabber i samme omfang, som bliver fundet i miljøet. En simpel dosis-responssammenhæng kunne dog ikke påvises.

The Danish Ministry of the Environment has instigated a series of projects aim-ing to clarify whether observed deformities in eelpout (Zoarcesviviparous)larvaeare caused by environmentally hazardous substances.FORMÅL is the third project with the aim to verify whether the candidate sub-stances indeed are the cause of the observed deformities. In order to fulfil theaim, FORMÅL consists of three parts: 1) a field study, 2) laboratory experimentswith eelpout, and 3) an integrated analysis based on both part 1 and 2 of FOR-MÅL, as well as on results from other on-going projects on eelpout.The conclusions of earlier literature-based projects indicated that substancessuch as heavy metals, organotin, polyaromatic hydrocarbons (PAHs), and halo-genated aromatic compounds like dioxins, PCBs and flame retardants werelikely candidates to have caused the deformities.These environmentally hazardous substances, as well as phthalates and per-fluorinated compounds (PFSA) were found in the eggs, muscle and liver of eel-pout females and larvae collected in a field study at three different sites. Strongcandidate substances were pointed out based on high concentrations in eel-pouts from two impacted sites where more than 5 % of the broods had morethan 5 % deformed fry compared to a reference site where no deformities wereobserved.To verify that the strong candidate substances could indeed be the cause of thedeformities in the eelpout fry, a laboratory-based controlled environment ex-periment was conducted. Both mixtures and single substances were used inrelevant concentrations. This report deals with the results of this experiment.A thorough investigation of the occurrence of deformities in the fry of exposedeelpout females was carried out and various anatomical parameters weremeasured.Moreover, various parameters and biomarkers were used to assess the uptakeand metabolism of the exposure compounds, and what biological mechanismsare affected by hazardous substances and result in the observed deformities ineelpout larvae. The biomarkers used in this study were PAH-metabolites,CYP1A-activity and calcium levels in the ovarian fluid and plasma.The main conclusions from the experiment are:

Det overordnede formål med undersøgelsesforløbet var at belyse årsagen tilmisdannelser i ålekvabbeunger (Stuer-Lauridsen et al. 2008). Hypotesen er, atden øgede forekomst af misdannelser i fiskeunger er forårsaget af miljøfarligestoffer, der inducerer toksiske effekter og processer, som kan lede til misdan-nelser.Bekræftelse af hypotesen forudsætter, at man kan etablere en årsagssammen-hæng mellem udsættelse for kandidatstoffer og de observerede misdannelser.Derfor er der blevet gennemført et kontrolleret laboratorieforsøg, hvor drægtigeålekvabbehunner er blevet udsat for stærke kandidatstoffer i blandinger og somenkeltstoffer i miljørelevante koncentrationer.I denne delrapport sammenfattes resultaterne af de biologiske og kemiske må-linger i eksponerede ålekvabbehunner og -unger, som er blevet udført i labora-torieforsøget.

Kandidatstoffer og doserStofferne og deres doser i eksponeringen i laboratorieforsøgene er valgt ud framålinger dels i ålekvabber (delrapport I) og dels i muslinger og sediment (del-rapport III) fra undersøgelsesforløbets trin 1. Kandidatstofferne er udpeget pågrundlag af forekomst af forhøjede koncentrationer i ålekvabber i belastede om-råder med høj hyppighed af misdannelser (Roskilde og Frederiksværk) i forholdtil en ”ren” referencelokalitet med lav hyppighed af misdannelser (Agersø).Det samlede billede af forekomst og koncentrationer af miljøfarlige stoffer pe-gede på kobber, organotin, PAH’er, chlorerede dioxiner og dioxinlignende poly-chlorerede biphenyler (PCB’er) som stærke kandidater til at være årsag til deobserverede misdannelser, samt bromerede flammehæmmere, perfluoreredeforbindelser og nonylphenol som kandidatstoffer.I laboratorieforsøgene udvalgtes 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)som repræsentant for de chlorerede dioxiner og de dioxinlignende PCB’er, py-ren som repræsentant for PAH’erne, tributyltin som repræsentant for organotin-forbindelserne, PFOS (perfluorooctansulfonsyre) som repræsentant for deperfluorerede forbindelser, og 2,2’,4,4’-tetrabromodiphenylether (BDE-47) somrepræsentant for de bromerede flammehæmmere.TCDD og pyren (PAH) tilhører stofgrupper, der påvirkerAh-receptorenog her-ved CYP-systemet, som kan forårsage bl.a. oxidativ stress, interferens medproteiner og DNA og effekter på vitamin- og hormonbalancen (Sturve et al.2005, Alsop et al. 2007, Billiard et al. 2008). TCDD og PAH’er er blevet påvist atforårsage ødem pga. osmoregulatoriske effekter, leverskader, kardiovaskulær11

dysfunktion, tidlig død, blommesækødem og skeletmisdannelser – især kæbe-og øjendeformiteter – i fiskeunger (Hose et al. 1982, Hannah et al. 1982, Giesyet al. 2002, Incardona et al. 2004, Antkiewicz et al. 2005, Carney et al. 2006,Farwell et al. 2006, Incardona et al. 2006, Yamauchi et al. 2006).TBT kan – ud over at påvirke CYP- og hormonsystemet (Fent 1996, Morcillo etal. 2004, Mortensen & Arukwe 2007, 2009) – også påvirke ion- og næringsstof-transport over cellemembraner (Selwyn 1976). Dette påvirker bl.a. pH-gradien-ter over cellemembraner og calciumtransport. Skader på cellemembranenstransportenzymer og andre virkninger på ATPasen påvirker energibalancennegativt og interfererer med osmoreguleringen (Fent 1996, Hartl et al. 2000).Det er påvist, at TBT er genotoksisk i fisk i miljørelevante koncentrationer(Micael et al. 2007), og det kan føre til reduceret klækning og deformiteter i fisk– bl.a. abnorm øjen- og muskeludvikling (Fent 1992, Nakayama et al. 2005,Hano et al. 2007).Akkumulering af metaller – inklusive kobber – kan forårsage en øgning af’Reactive Oxygen Species’ (ROS), som forårsager oxidativ stress. Trods forhø-jet antioxidantforsvar kan oxidativ skade ske, når organismer bliver eksponeretfor kemiske stoffer, hvis systemet ikke kan følge med. Oxidativ stress medførertypisk skader på cellemembranens lipider og på proteiner. Kobber er blevet på-vist at medføre DNA-skader (Chairi et al. 2010, Santos et al. 2010) og at forstyrremitokondriel respiration (Craig et al. 2007, Garceau et al. 2010) og metalbin-dende enzymer (Craig et al. 2009, Atli & Canli 2010, Chairi et al. 2010). Udsæt-telse for subletale kobberkoncentrationer medfører typisk blommesækødem ogrygsøjlekrumning (Adema-Hannes & Shenker 2008). Kobber reducerer vitaminA-koncentrationer (Alsop et al. 2007) og forstyrrer ionbalancen (Stouthart et al.1996, McGeer et al. 2000). Desuden reducerer det optagelsen af æggeblommei fiskeunger og har derfor effekter på metabolisme og vækst (Stouthart et al.1996, Johnson et al. 2007, Witeska et al. 2010). Effekter på nervesystemet oghjerterytmen er også rapporteret efter eksponering for kobbersalte (Johnson etal. 2007).Bromerede flammehæmmere forårsager adskillige udviklingsmæssige defekter ifiskeunger, bl.a. på rygsøjle og hjerte (Lema et al. 2007), blommesækødem(Kammann et al. 2006), effekter på P-450 aktivitet og oxidativ stress (Tjärnlundet al. 1998, Kling et al. 2008). Stofferne påvirker ligeledes både kønshormon-og thyroidhormonsystemet (de Wit 2002, Hamers et al. 2006).PFOS forårsager oxidativ stress og hepatocytapoptose (Oakes et al. 2005, Liuet al. 2007, Han et al. 2010). Det sidstnævnte kan skyldes, at PFOS skader cel-

lemembranerne og interfererer med DNA-metabolismens homeostase (Hoff etal. 2003). Ud over også at interferere med thyroidhormonerne, som spiller envigtig rolle for normal udvikling og fysiologisk funktion i fisk (Shi et al. 2008,2009), påvirker PFOS også steroidhormonbalancen (Oakes et al. 2005). Gene-relt forårsager PFOS mange forskellige typer misdannelser på fiskeunger pga.bl.a. apoptose i de embryonale celler (Shi et al. 2008).Nonylphenol har en række effekter på fisk. Blandt andet virker det hormonfor-styrrende og inducerer bl.a. vitellogeninsyntese i hanner og reduceret ægpro-duktion og fertilitet (Christiansen et al. 1998, Ishibashi et al. 2006). Endvidere erder observeret deformiteter hos afkom af eksponerede hunner samt hæmningaf CYP1-aktivitet og oxidativ skade på bl.a. æg (Kelly & di Giulio 2000, Mara-donna et al. 2004, Zhang et al. 2006, Meucci & Arukwe 2006, Zhang et al.2008).For yderligere oplysninger om effekter af de udvalgte stoffer henvises til rappor-ten ”Kemiske stoffer der kan føre til misdannelser i fisk” fra trin 1 af FORMÅL(Halling-Sørensen et al. 2008).De fleste af de udvalgte stoffer kan overføres fra moderfisk til æg eller afkom ogofte bioakkumulere dér til højere koncentrationer end i moderen pga. disse tidligelivsstadiers manglende evne til at metabolisere og udskille stofferne (Fent 1991,Giesy et al. 2002, Nakayama et al. 2005, Ohji et al. 2006, Rattfelt Nyholm et al.2008, Sharpe et al. 2010). De fleste stoffer kan også reducere klækningssucce-sen (fx Hose et al.1982, Fent & Meier 1994, Johnson et al. 2007, Adema-Hannes & Shenker 2008).Doserne af eksponeringsstofferne blev udvalgt ud fra to forskellige kriterier: 1)ud fra de målte koncentrationer i ålekvabber fra de to belastede områder (Del-rapport I) og 2) ud fra koncentrationen i blåmuslinger fra områderne (delrapportIII). Doserne i forsøget blev valgt, så eksponeringen af ålekvabberne var hen-holdsvis 10 og 50 gange højere, end den belastning ålekvabberne er udsat for ide to områder med forhøjet hyppighed af misdannelser. Der er i Appendiks Agjort mere detaljeret rede for beregningerne af doserne.Det blev ved en række små pilotforsøg sikret, at de valgte doser ikke medførteakut dødelighed for ålekvabberne.Der blev eksponeret for såvel enkeltstoffer som blandinger. Dette giver mulig-hed for at få et billede af blandingseffekter, som er den mest miljørelevante si-

Biomarkører og optagelse/metabolisme af organismefremmedestofferBiomarkører er biologiske indikatorer, der kan anvendes til at vurdere, om miljø-farlige stoffer påvirker og derved udgør en risiko for dyrelivet i vore farvande.Forekomsten af misdannelser i fisk som ålekvabben er et eksempel på en ge-nerel biomarkør, hvor det vil være nødvendigt med yderligere undersøgelser afbåde de kemiske og biologiske forhold for at sandsynliggøre årsagerne.Følgende biomarkører anvendtes i denne undersøgelse:Biometriske dataMisdannelser/unormal udvikling af ungerCYP1A-aktivitetCalciumindhold i ovarievæske og plasmaDesuden er det vigtigt at verificere, at de stoffer, fisken er blevet eksponeret for,er blevet optaget i vævet og eventuelt metaboliseret. Derfor blev følgende må-linger foretaget:Kemiske målinger i æg og unger (puljede prøver)Måling af PAH-metabolitter i galde (på individniveau)Misdannelser i unger og biometriMisdannelser i unger er den primære effekt, som blev målt i dette projekt for atvurdere, om miljøfarlige stoffer forårsager de misdannelser, som er observeret inaturen.Biometri, dvs. forskellige typer af fysiske mål, fx længde, vægt, levervægt m.m.,er brugt til at beregne fiskens kondition som et supplement til misdannelser.CYP-1A aktivitetI alle fisk findes cytochrom-P450-medierede enzymer, som indgår i den oxidativemetabolisme. Udover at omdanne en del af organismens egne stoffer som vi-taminer og hormoner, omdanner disse enzymer, og især enzymerne af typenCYP1A, organiske miljøfarlige stoffer såsom PAH og dioxinlignende stoffer, såde bliver mere vandopløselige og nemmere at udskille. En vigtig egenskab veddisse enzymer er, at de er inducérbare, dvs. at aktiviteten øges som respons påen stigende påvirkning. En forhøjet CYP1A-enzymaktivitet medfører bl.a. oxida-tiv stress i form af en øget produktion af reaktive metabolitter med særlig højtoksicitet, fx epoxider af PAH, der kan have en mutagen og kræftfremkaldendevirkning ved at forvolde skader på DNA. Disse egenskaber gør CYP1A-14

aktiviteten anvendelig som biomarkør. Man skal dog være opmærksom på, atsæsonmæssige variationer i enzymaktiviteten er velkendte, og forskelle ogsåkan skyldes bl.a. kønsforskelle og reproduktiv status. Det er derfor vigtigt atsammenligne grupper af fisk indsamlet under ensartede forhold, hvilket også ertilfælde i dette forsøg.Calcium i ovarievæske og plasmaDa ålekvabben er levendefødende, er det en god modelart til at studere effek-terne af toksisk påvirkning af afkommet gennem moderen og direkte påvirknin-ger af ynglen. Ved reproduktionen frigives æggene fra ovariet ind i ovariesæk-ken, og befrugtningen sker umiddelbart efter. Cirka 3 uger efter befrugtningenklækker larverne. Herefter ligger larverne frit i ovariesækken. Deres vækst ergennem den første måneds tid afhængig af blommesækken. I denne periodesker bl.a. differentiering af gonader. Herefter, indtil fødsel ca. 5 måneder efterklækning, er ynglen afhængig af de næringsstoffer i ovarievæsken, som dannesgennem denne periode. Miljøet inde i ovariet og ovarievæskens indhold kanderfor tænkes at have stor betydning for udviklingen af ynglen.Calcium indgår som en vigtig komponent i opbygningen skelettet og andre vitaledele, og det optages aktivt af ynglen. Igennem hele perioden bliver afkommetudsat for de forureningsstoffer moderen udsættes for gennem udveksling overovariesækkens væg (Rasmussen et al. 2002). Forskning har vist, at østrogenestoffer – både naturlige og forureningsstoffer – kan påvirke mængden af ovarie-væske og indholdet af calcium (Rasmussen et al. 2002).Optagelse og omsætning af kandidatstofferVed eksponeringsforsøg er det vigtigt at vide, hvor meget af de anvendte stofferfisken reelt optager i vævet og i dette tilfælde videregiver til ungerne. Stoffersoptagelsesgrad afhænger af mange faktorer såsom eksponeringsmetode ogstoffets biokemiske egenskaber som fx fedtopløselighed.Koncentrationen af et stof på et givent tidspunkt siger ikke nødvendigvis alt omden eksponering, ålekvabberne er udsat for. Mange stoffer bliver omsat (meta-boliseret) i organismer, herunder organotin, nonylphenol, phthalater, PFAS ogPAH’er. Metabolisering bevirker, at stofferne bliver mere vandopløselige ogderved lettere at udskille. Andre stoffer såsom visse dioxiner, dioxinlignendePCB’er og bromerede flammehæmmere har en meget lavere omsætning i or-ganismen eller bliver slet ikke nedbrudt. Disse oplagres typisk i cellemembranerog lipiddepoter. Stoffer, der ophobes i lipiddepoter, bliver ofte frigivet igen i peri-oder, hvor fiskene har brug for ekstra energi – fx i den reproduktive periode. Forat få et mere reelt billede af den belastning fra stoffer fiskene er udsat for, er det

derfor nødvendigt at foretage målinger af stoffer og metabolitter i væv og krops-væsker.PAH-metabolitterSkadelige PAH’er (dvs. tjærestoffer) bliver forholdsvis hurtigt omsat af CYP1A-enzymsystemet til mere vandopløselige metabolitter (se ovenfor), som dervednemmere udskilles fra fisk, primært via galde og urin. Niveauet af PAH-metabo-litter i galde kan derfor anvendes som et mål for belastning med PAH, men detskal ses i forhold til, i hvilken grad CYP1A-enzymet er induceret og derved i hø-jere grad har potentiale til at danne disse metabolitter. Den primære PAH-meta-bolit i fiskegalde er 1-hydroxypyren.Selv om PAH-forbindelser bliver hurtigt omsat, kan en del af dem alligevel væreskadelige for organismen, bl.a. eftersom de bliver omdannet til særligt reaktivemellemstoffer (metabolitter), som kan reagere med og dermed skade cellernesDNA og proteiner.

IndsamlingÅlekvabber til forsøget blev fanget i ruser i farvandet rundt om den lille ø Birk-holm, der ligger ca. fire km sydvest for Tåsinge i Det sydfynske Øhav. Områdeter uden indlysende forureningskilder. Fiskene blev leveret i Skovballe på Tåsingeog transporteret i en gennemluftet tank på en trailer til feltstation Kerteminde,hvor de blev overflyttet til et opbevaringskar.På feltstationen i Kerteminde blev tre til fem hunner aflivet med henblik på be-stemmelse af deres reproduktive status. Den 7. september 2010 kunne vi kon-statere, at fire ud af fire undersøgte hunner havde ovuleret, og at befrugtningenvar sket. Følgelig blev forsøget sat i gang den 10. september 2010. Ålekvab-berne, der indgik i forsøget, var indfanget henholdsvis den 7. og den 9. septem-ber.

Kemikalier og blandingerDe drægtige ålekvabbehunner blev eksponeret for en blanding (Dk-blanding) afde kemikalier, der i projektfase 1 fremstod som de stærkeste kandidatstoffer(TBT, PAH, dioxin), og som ifølge litteraturen har forskellige virkemekanismer.Der anvendtes to dosisniveauer af denne blanding, Dk10 og Dk50 (tabel1).Derudover eksponeredes en gruppe for en blanding (Dk+-blanding) af nonyl-phenol, en bromeret flammehæmmer BDE 47 (2,2',4,4'-tetrabromodiphenylether) og PFOS ved en koncentration. Disse stoffer forventes at have lignendevirkemekanismer som dem i Dk-blandingerne. De to blandinger kombineredesogså i en eksponering (Dk50+). De resterende grupper af fisk blev eksponeretfor enkeltstoffer fra Dk50-blandingen (tabel1).Der blev taget højde for eventuelle ukendte virkninger af karrenes størrelse vedat duplikere eksponeringen for Dk10, Dk50 og Dk50+ samt kontrol, således atder eksponeredes i både store og mindre kar (tabel1).Stofferne blev administreret ved opblanding i jordnøddeolie, og eksponeringenskete ved en enkelt intraperitoneal injektion ved forsøgsstart (se længere nede).Kobber blev administreret særskilt, og ikke i blandingerne, da det ikke er oplø-

seligt i jordnøddeolie. Kobber blev derfor administreret opløst i destilleret H2O.Eksponeringen er angivet itabel 1.Tabel 1. Forsøgsgrupper og eksponeringsniveau af stoffer.GruppeKontrolDk10Dk50Dk50+KontrolDk10Dk50Dk50+Dk+TBTPyrenTCDDCuAntal fisk(start)2020202310101010101010102x55 ng Sn-TBT + 200 ng pyren + 10 pgTCDD25 ng Sn-TBT +1 �g pyren + 50 pg TCDD25 ng Sn-TBT + 1 �g pyren + 50 pg TCDD +500 ng NP + 2,5 ng BFR + 500 ng PFOS500 ng NP + 2,5 ng BFR + 500 ng PFOS25 ng Sn-TBT1 �g pyren50 pg TCDD1 �g Cu5 ng Sn-TBT + 200 ng pyren + 10 pgTCDD25 ng Sn-TBT + 1 �g pyren + 50 pg TCDD25 ng Sn-TBT + 1 �g pyren + 50 pg TCDD +500 ng NP + 2,5 ng BFR + 500 ng PFOSEksponering(per g vådvægt hun)

ForsøgsopstillingForsøget blev foretaget på Syddansk Universitet, Marinbiologisk Forsknings-center i Kerteminde, som har tilladelse til at udføre dyreforsøg. Her var opstilletfire store, otte mindre (178 l) og to små kar, alle med gennemstrømmende hav-vand og gennemluftning.Efter forsøgsstart blev karrene tilset dagligt og døde fisk noteret og fjernet.Vandgennemstrømning og lufttilførsel blev ligeledes kontrolleret, og vandtempe-raturen blev målt. De første to uger blev fiskene ikke fodret, da de virkede lidtstressede og ikke havde interesse for føde. Herefter blev de fodret med hakkedemuslinger, først én gang om ugen, siden to og til sidst i forsøget tre gange omugen. Muslingerne var importeret fra Chile (Pesquere, San José) og var forkogte.ForsøgsstartPå forsøgets dag 0 blev hunfisk tilfældigt udvalgt til de forskellige grupper. Deblev bedøvet i ca. 0,002 % phenoxyethanol og vejet. Ud fra vægten af hver en-

kelt fisk blev mængden af eksponeringsblanding udregnet og 4,16 �l jordnød-deolie/g fisk blev injiceret i bughulen.En række prøver blev udtaget fra 10 ueksponerede fisk til bestemmelse af T0-værdier for de forskellige biomarkører. Desuden blev yderligere seks fisk injice-ret med Dk50+. Disse fisk blev aflivet efter 3 døgn, og vævsprøver blev udtagettil måling af optagelse af eksponeringsstofferne i æg.Afslutning af forsøgetForsøget blev afsluttet i uge 44, efter 7½ uge. Prøvetagningen tog i alt fire dage,så ikke alle forsøgsgrupper blev afsluttet samme dag. Ålekvabberne blev bedø-vet i 0,002 % phenoxyethanol og derefter vejet og målt.Først blev blod udtaget fra den caudale vene med en hepariniseret kanyle, oget blodsmear blev lavet på et objektglas. Ovarievæske blev udtaget ved at stik-ke en kanyle gennem bugvæggen ind i ovariesækken.Vævsprøver og æg/unger blev udtaget ved dissektion umiddelbart efter, at devoksne fisk var blevet aflivet med et kraftigt slag i hovedet. Ynglen blev dissekeretud af ovariesækken og vejet. Resten af ovarievæsken blev siet fra og vejet.Ynglen blev bedøvet med mineralvand, talt og sorteret efter misdannelser, ogbilleder blev taget af hele kuldet. Herefter blev længden af alle embryonernemålt, og de blev efterfølgende nedfrosset til kemiske analyser.De udtagne vævsprøver skulle, ud over at anvendes til de i dette projekt udvalg-te analyser for biomarkører og miljøfarlige stoffer, også kunne anvendes til an-dre supplerende undersøgelser i forbindelse med BONUS+-projekterne BAL-COFISH og BEAST. Dette indebar, at nogle af vævsprøverne blev opdelt i fleredelprøver: fx blev lever og muskel opdelt i henholdsvis syv og fire delprøver. Al-le delprøver blev registeret og opbevaret separat i en biobank, så senere identi-fikation og analyser af individbaserede prøver kunne gennemføres. Ovariesæk-ken blev til sidst udtaget, vejet og konserveret, og fiskens somatiske vægt (udenindre organer) blev noteret.

Biometriske dataFølgende biometriske mål blev taget på alle fisk: længde (til nærmeste 0,5 cm),totalvægt, vægt uden indvolde og gonader, vægt af lever, vægt af kuld, vægt afovariesæk og ovarievæske, antal unger i kuld og ungernes længde.Ud fra disse data blev følgende udregnet:Konditionsindeks (KI) voksne hunner (vægtuden indvolde(g)/længde3(cm))*100)Leversomatiske indeks (LSI) (levervægt (g)/ vægtuden indvolde(g)*100)Gonade-somatisk indeks (GSI) (ungers vægt (g) + vægt af ovariesæk(g) + vægt af ovarievæske (g)/ vægtuden indvolde(g) *100)Konditionsindeks unger (KIu) (gennemsnitsvægt af unger fra kuld(g)*100/gennemsnitslængde3(cm) af unger fra kuldReproduktiv kapacitet (RK): Antal unger uden dværgvækst/hunnensvægt uden indvolde (g)

Tabel 3. Karakterisering af forskellige typer af fejludviklede unger i kuld fra ålekvabbe(efter Strand & Dahllöf 2005).0ABCDEFGHIBefrugtede æg eller embryoner, der lige er klækket (< 10 mm)Døde unger uden misdannelser (> 10 mm)Unger med misdannelser i blommesæk eller indvoldeUnger med ’vinkelknæk’ på rygradUnger med spiralformet rygradUnger med defekt på øjne eller manglende øjneUnger med misdannelser i hovedetTo sammenvoksede unger, eventuelt som siamesiske tvillingerAndre abnormiteter, evt. som kalcificerede unger eller sammenfiltrede klyngerSignifikant mindre unger, ’dværgvækst’

Misdannede unger blev karakteriseret visuelt som tilhørende type B-G. Der varingen forekomster af type H.En længdefordeling af ungerne blev fundet ved at måle længden af alle levende,normalt udviklede unger i længdegrupper á 2,5 mm. Normalt tilhører næstenalle unger i et kuld tre grupper. De unger, der faldt to kategorier under de trehovedgrupper, blev kategoriseret som dværge (type I).Denne karakterisering af markante, synlige misdannelser udelukker ikke, at an-dre ikke umiddelbart synlige skadelige effekter på ungeudviklingen, fx i form afskader på nervesystemet eller blodkredsløbet, er til stede.Calciummålinger i blod og ovarievæskePrøver af blod på 0,5-1 ml til calciumanalyser blev udtaget med hepariniseret 1ml sprøjte med kanyle. Plasma blev udtaget og frosset ned på tøris efter centri-fugering i Eppendorfrør ved 2.500 rpm i fem minutter. Herefter blev plasma fros-set ved -80�C indtil analyse.Ovarievæske til calciummålinger blev ved prøvetagningen i november udtagetmed en kanyle gennem bugvæggen på den aflivede fisk og overført til Eppen-dorfrør. Herefter blev væsken frosset ved -80�C indtil analyse.Før analyse blev prøverne fortyndet 100 gange i 0,1 % La2O3. Koncentrationen aftotalt calcium (fri og bundet) i ovarievæske og -plasma blev målt med atomab-sorptionsspektrofotometri (Perkin Elmer).CYP1A-analyserLeverprøver til måling af aktiviteten af CYP1A-afgiftningsenzymer blev nedfros-set i flydende kvælstof direkte efter afvejning og opbevaret ved -80�C. Aktivite-21

ten af CYP1A blev målt som EROD (Ethoxyresorufin-O-deethylase) i S9-fraktionen af en homogeniseret lever fra de drægtige ålekvabbehunner og nor-maliseret til proteinniveauet målt ved Bradford-metoden. Analyserne blev udførti henhold til ICES guideline (Stagg & McIntosh 1998).Kemiske analyserDe 10 ekstra fisk, som blev eksponeret for Dk50+-blandingen i starten af forsø-get, samt ikke eksponerede fisk fra T0 blev brugt til at vurdere kemikaliekoncen-trationen i æg. Tre dage efter injektionen blev disse fisk aflivet. Æg fra samtligeindivider blev puljet og efterfølgende delt op til analyser af de forskellige stoffer.På samme måde blev unger fra Dk50+-blandingen og kontrollen puljet til sidst ieksperimentet, og de tilsvarende analyser blev foretaget som et mål for ekspo-nering i løbet af forsøget.Samtlige analyser blev udført ved DCE - Nationalt Center for Miljø og Energi(det tidligere DMU), Aarhus Universitet, ifølge de tekniske anvisninger for NO-VA/NOVANA (Pedersen et al. 2004a-c; Strand & Dahllöf 2005). Analysemeto-der, detektionsgrænser og usikkerhed for samtlige stoffer findes i Annex 1, tabel2. Usikkerheder er angivet som de akkrediterede usikkerheder, idet der ikke varmulighed for dobbeltbestemmelser.Analyser af PAH-metabolitterI de grupper af ålekvabber, der i dette eksperiment også blev eksponeret for py-ren (enten alene eller i en blanding), blev koncentrationerne af PAH-metabolit-ten 1-hydroxypyren bestemt ved brug af fluorescens-metoden Synkron Fluore-scens Scan (delta 41nm) på prøver af galde og urin, der var fortyndet henholds-vis 2000 og 100 gange i methanol:vand (50 % v/v). Koncentrationen blev be-stemt ved ekstern kalibrering til en standard af 1-hydroxypyren, og derpå juste-ret med faktor 1,7 for at korrigere for den højere fluorescens af konjugeredesammenlignet med dekonjugerede pyren-metabolitter (Tairova et al.in press).Som en del af kvalitetssikringen har denne metode i 2010 også opnået tilfreds-stillende resultater i en international interkalibrering om PAH-metabolitter i fiske-galde i 2010 (Kammann 2010).

I overvågningssammenhæng betragtes et kuld som påvirket, når der er 5 % ellerflere deforme unger (type B-G). Denne grænse er beregnet efter den forekomstaf deformiteter, som findes i områder med lille og diffus belastning af miljøfarligestoffer. Når man summerer alle grupper af misdannelser under betegnelsen ab-norm udvikling, er grænsen for påvirkning på tilsvarende måde sat til mere end10 % med abnorm udvikling i et kuld, da der også er naturlig forekomst af unor-mal tilvækst oven i deformiteter.Hyppighederne af de forskellige typer af misdannelser blev opgjort i de enkeltegrupper dels som gennemsnit af antal unger, og dels som procent af kuld indenfor hver behandling med mere end 5 % misdannelser af type B-G, og med mereend 10 % misdannelser af alle typer (abnorm udvikling). Signifikante forskelle imisdannelser mellem de eksponerede fisk og kontrol blev testet ved en ensidetChi2med Fisher’s exact test, som bruges, når antal individer i de forskelligegrupper er lavere end fem i én af grupperne.Til de biometriske målinger blev envejs variansanalyse (ANOVA) anvendt, efter-fulgt af Bonferroni's Multiple Comparison Test, for at sammenligne de forskelligegrupper baseret på middelværdier. Forskelle i konditionsindeks for unger og re-produktiv kapacitet mellem procent af kuld inden for hver behandling blev der-udover vurderet ved Chi2med Fisher’s exact test.Analyserne blev foretaget ved hjælp af GraphPad Prism 5, og der blev anvendtet signifikansniveau påα= 0,05.

Eksponering af æg og ungerAlle stoffer, undtagen pyren, blev målt på puljede prøver af æg og unger, hvor-imod PAH-metabolitter blev målt i individuelle hunner som et mål for pyreneks-ponering.PAH-metabolitterDer var lave niveauer af PAH-metabolitter i de indfangede fisk samt i kontrolfisktre dage efter injektion (figur1).Koncentrationerne var forhøjede i Dk50+-fiskefter tre dage, hvilket tyder på en igangsat metabolisering. Den store variation ikoncentration for DK50+ fisk kan være et udslag af såvel individuelle forskelle imetabolisering, som variation i eksponeringssucces.

Overførsel fra moder til æg og ungerDen beregnede TBT-eksponering for hunner (125 �g Sn/kg tørstof (TS)) var ca.10 gange højere end den samlede TBT- og TPhT-mængde, som blev målt i åle-kvabbehunner i feltstudiet. Tilsvarende var den beregnede eksponering af hunnerfor dioxinen TCDD (250 ng/kg TS) 1000 gange højere end det, som blev måltfor TCCD i felten. Regnet som TEQ, var eksponeringen 10 gange højere end ifelten.For PFOS og NP kendes niveauerne i voksne ålekvabber fra felten ikke, menden beregnede eksponering af hunner var 2.500 ng/kg TS for begge stoffer.Da stofferne ikke blev målt direkte i hunnerne (undtaget pyren, som dog ikkeblev målt i æg og unger), kan overførsel ikke beregnes på traditionel vis. Der-imod kender vi mængden af injiceret stof i hunnernes bughule, koncentrationer ipuljer af æg og unger, samt vægt af hunner, æg og unger. Derved kan den pro-centuelle overførsel af injicerede mængde i hunner til æg og unger beregnes,uden at optagelsen i moderfisken er kendt.Stofferne var kun i mindre mængder overført til æggene tre dage efter ekspone-ringen af hunnerne (tabel4).

Biometri og konditionDer var ingen effekter på fiskernes grundlæggende biometri. Gennemsnits-længden for de drægtige ålekvabber var 28,0 cm (fra 19,8 cm til 33,0 cm), ogderes vægt var i gennemsnit 108,2 g (fra 46,9 g til 193,0 g). Der var en stor in-dividuel variation i størrelsen af kuldene, men uafhængigt af eksponeringssta-tus. Gennemsnittet lå på 110,6 unger/kuld. Vægten af hele kuldet var i gennem-snit 15,3 g, og længden og vægten af de individuelle unger var i gennemsnit34,4 mm og 0,139 g ved forsøgets afslutning. Vægten af ovariesæk og ovarie-væske var heller ikke påvirket af eksponeringen. Biometri for de forskellige be-handlinger findes i Annex A.Fiskenes kondition blev også vurderet ved en række indeks (tabel5).Konditi-onsindekset (KI) faldt fra forsøgets start til dets afslutning (se Annex A), hvilketskyldes den metabolske omkostning ålekvabbehunnerne har ved at forsørge devoksende unger. Det leversomatiske (LSI) og gonadesomatiske (GSI) indeksvar i gennemsnit henholdsvis 2,1 og 34,8 %.Tabel 5. Konditionsindekser for hunner ved forsøgets afslutning. LSI - lever somatiskindeks, KI - konditionsindeks, GSI - gonadesomatisk indeks, RK - reproduktiv kapacitet.GruppeKontrolDk10Dk50Dk50+Dk+TBTPyrenTCDDCuAntal fisk1317201675557LSI2,1 � 0,92,0 � 0,81,9 � 0,62,2 � 0,62,0 � 0,71,9 � 1,12,2 � 1,02,1 � 0,72,2 � 0,5KI0,33 � 0,040,33 � 0,030,32 � 0,030,31 � 0,020,32 � 0,050,31 � 0,020,32 � 0,050,30 � 0,030,32 � 0,03GSI34,7 � 9,733,5 � 12,428 � 9,132,8 � 1137,6 � 8,240,2 � 11,928,3 � 12,838,2 � 5,839,4 � 4,9RK166 � 46146 � 65129 � 63132 � 68161 � 37137 � 61109 � 61136 � 33145 � 44

EksponeringVurderet ud fra koncentrationerne af kandidatstofferne i æg og unger i Dk50+-gruppen syntes eksponeringen at være forholdsvis vellykket, idet koncentratio-nerne i æg og unger var på niveau med eller højere end koncentrationerne fun-det ved Roskilde og/eller Frederiksværk. Da de enkelte stoffer er udvalgt somrepræsentanter for stofgrupper, er det derfor ikke urealistisk at antage, at blan-dingerne dækker det miljørealistiske niveau hos ålekvabber i belastede områ-der.Nonylphenol var det eneste stof, hvor koncentrationen var markant højere i ægend i unger tre dage efter injektionen. Da nonylphenol – i modsætning til de an-dre kandidatstoffer – er hurtigt omsætteligt (T½= 10 timer hos hundestejle, Eke-lund et. al. 1990) hos fisk, er dette resultat ganske som forventet.I dette forsøg blev eksponeringen målt ved at pulje æg og unger i Dk50+-eksponeringen, hvor alle stoffer undtaget kobber indgik. Derved er der ikke mu-lighed for at vurdere individuelle forskelle i eksponering.PAH-metabolitter i hunner kan dog bruges som en indikation på individuelle va-riationer i eksponering, som kan skyldes individuelle forskelle i optag og meta-bolisering. De store variationer mellem individer i såvel Dk50+- som pyren-eksponerede fisk tyder på, at der er stor forskel i eksponering mellem individersamt i metabolisering løbet af forsøget.

Misdannelser og abnorm udvikling af ungerDer var en overordnet tendens til, at eksponeringen for de udpegede kandidat-stoffer forårsagede en forøget frekvens af misdannelser (type B-G) i ungerne. Ikontrollen, TBT og kobber forekom ikke kuld med mere end 5 % deformiteter aftype B-G, hvorimod de andre eksponeringer havde en effektstørrelse på mellem5 og 40 %, dvs. over niveauet for naturligt forekommende misdannelser, og påstørrelse med de niveauer man finder i forurenede områder. Dk10, Dk50, Dk50+,samt TCDD var de eksponeringer, som gav kuld med mere end 10 eller 20 %misdannelser af type 0, I og total abnorm udvikling.En forholdsvis stor dødelighed blandt forsøgsdyrene betød, at kun effekter, somvar mere end 35 % større end i kontrolgruppen, faldt signifikant ud, når antalfisk i de enkelte grupper var flere end 12. Tilsvarende krævedes en effektstør-37

relse på 50 % for eksponeringsgrupper med mindre end 10 fisk i hver. Styrken itestene var derfor lille, eftersom der kræves mellem 35 og 50 % effektøgning iforhold til kontrol, hvis der skal opnås et signifikansniveau på 5 %. Til sammen-ligning kan det noteres, at den signifikante detektérbare forskel af effektstørrelse iovervågningssammenhæng er 10 %, eftersom der undersøges 50 kuld pr. stationfor at dække variationen i effekter mellem individer fra den samme lokalitet. Dafisk fra miljøet blev brugt i forsøget, indgår den naturlige variation i følsomhedog kondition mellem individer, selv om hunnerne havde de samme forhold eftereksponering.Misdannelsesfrekvenser på 35-50 % er betegnende for stærkt forurenede om-råder. I de to forurenede lokaliteter Roskilde og Frederiksværk, hvilke ekspone-ringen i dette forsøg er baseret på, var effekterne i 2002 høje (20-55 %), menhar i de efterfølgende år været omtrent 10-15 % for type B-G. Tilsvarende be-tragtes områder som referenceområder, hvis der er mindre end 5 % af antalkuld, som har > 5 % deformiteter af type B-G. For abnormt udviklede unger erbaggrundsniveauet tilsvarende mindre end 10 % abnormt udviklede unger.I dette tilfælde, når den statistiske styrke er lille, kan man ikke konkludere, atstofferne ikke har en effekt, selv om antallet af signifikante resultater er lavt.Som supplement kan man derfor bruge en weight-of-evidence (WOE) tilgang,hvor effektstørrelserne også inddrages. Som tærskelværdier i weight-of-evidence tilgangen bruges den signifikant detekterbare effektstørrelse i felten,når man undersøger kuld af 50 hunner, dvs. en forskel på 10 %.TBT og Dk+ var de to eksponeringer, som resulterede i de mindste effektstør-relser i forhold til kontrollen, efterfulgt af Dk50 (tabel6).Kobbereksponeringhavde flest indikatorer (fem af seks) med effektstørrelse > 10 % af kontrol,mens de øvrige havde fire af seks.Tabel 6. Forskel i effektstørrelse i forhold til kontrolgruppen (%). Mørke felter viser ef-fektstørrelser > 10 %. Negative værdier indikerer, at der var færre misdannelser end ikontrolgruppen.

ringsstofferne, men det kan også have andre årsager. Generel stress eller hvishunålekvabberne er udsatte for hypoxi, kan også føre til tidlig død af unger(Strand et al. 2004, Eriksen et al. 2006). Indfangning og overførsel til laborato-rieforhold, næsten uden tid til akklimatisering, kan være den stress, som var år-sag til såvel type A og I effekter som dødelighed af ålekvabbehunner.Den hyppigst forekommende misdannelse i de fleste grupper, inklusive kontrol-gruppen, var spiralformet rygrad efterfulgt af vinkelknæk på rygraden. Andrestudier, hvor forekomst af misdannelser i vilde ålekvabber er blevet undersøgt,har også noteret fortrinsvis rygsøjlemisdannelser (Strand et al. 2004, Gerckenet al. 2006).En tilsvarende WOE-tilgang for de biomarkører, som blev målt i ålekvabbehun-ner (tabel7),viser igen, at Dk+ og TBT, denne gang sammen med TCDD, vareksponeringerne med de færreste forskelle i forhold til kontrol, efterfulgt af kobberog pyren.Tabel 7. Forskel i effektstørrelse i forhold til kontrolgruppen. Mørke felter viser effekt-størrelser på mere end 10 %.

Sammenhæng mellem eksponering og effekterMisdannelserSelv om effekterne i de eksponerede kuld var større end i kontrolkuldene, varder ikke en simpel sammenhæng mellem størrelsen af effekten og ekspone-ringsniveauet eller typen af stof. For deformiteter (type B-G) svarer Dk10 dog tilen additiv effekt af enkeltstofferne TBT, pyren og TCDD, og DK50+ svarer til enadditativ effekt af Dk50 og Dk+. Men effekten af såvel Dk50 som Dk50+ varmeget mindre end, hvad der kunne forventes ved additive effekter af enkeltstof-ferne.Dette kan skyldes to ting: 1) at eksponeringen ikke ramte det rigtige tidspunktfor alle individer, 2) at der er antagonistiske interaktioner, når en fisk samtidigtudsættes for mange stoffer i høje koncentrationer.Det er veldokumenteret, at udviklingen af skelet, muskler og organsystemer erspecielt følsom over for påvirkninger fra teratogene stoffer i en begrænset peri-ode (Manson & Wise 1991, Bentivegna & Piatkowski 1998). Misdannelser, tera-39

togene effekter, induceres i perioden fra ægget anlægges i hunner (vitellogene-sen) op til klækningstidspunktet (Bodammer 1993). Ved at injicere kandidatstof-ferne i bughulen inden for en periode på ca. 7 dage efter befrugtningen, var endel af den følsomme periode dækket i forsøget.Mange af de stoffer, som blev brugt i forsøget, interagerer med de samme re-ceptorer og proteiner i cellerne. Denne type af interaktioner kan være såvel for-stærkende (agonistiske) som hæmmende (antagonistiske). I dette forsøg vardet ikke muligt at inkludere alle de nødvendige kombinationer af stoffer og ke-miske analyser for at kunne lave en kvantitativ vurdering af interaktionseffekter.Dog er der indikationer på antagonistiske effekter, når man betragter fx Dk50 ogDk10. Hvor der er en additiv effekt af enkeltstoffer i Dk10, er der et lavt effektni-veau i Dk50 – endda lavere end i Dk10. Dette peger på, at der er antagonistiskeeffekter mellem TBT, pyren og TCDD, når niveauerne bliver høje nok, forudsatat optagelsen er ens ved de forskellige eksponeringer. Antagonistiske effektermå også forudsættes at være til stede i miljøet, hvor ålekvabber altid vil væreeksponerede for en blanding af stoffer.Leversomatisk indeksMange forureningsstoffer forårsager leverforstørrelse i fisk (fx Celander et al.1994, Vetemaa et al. 1997, Gercken et al. 2006). Sturve et al. (2005) fandt bl.a.et forhøjet LSI i ålekvabber i Gøteborg Fjord efter uddybning af fjorden og knyt-tede det til eksponering for PAH. Ligeledes har Strand et al. (2004) fundet for-størret lever i ålekvabber i områder i danske farvande med forøget forekomst afmisdannede unger. I nærværende forsøg fandt vi ingen signifikante forskellemellem LSI i kontrolgruppen og de eksponerede grupper.I en undersøgelse hvor ålekvabber blev fanget i et relativt rent område af Katte-gat nær den svenske kyst, lå LSI i august måned i gennemsnit lidt under 2 %(Ronisz et al. 1999). Dette er en lille smule lavere end i vores forsøg. Det videsdog ikke, hvor mange af de indre organer, der var blevet fjernet i det svenskeforsøg, ligesom størrelsesfordelingen for fiskene ikke var angivet. På den andenside kan den højere LSI indikere, at fiskene har været udsat for miljøfarlige stof-fer på fangststedet eller i vandet fra havnen i Kerteminde. Forstørrelse af leve-ren i forbindelse med eksponering for forurenende stoffer er formodentlig relate-ret til en generel forstyrrelse af stofskiftet og/eller induktion af beskyttende me-kanismer inklusivde novosyntese af enzymer. Desuden kan eksponering forhormonforstyrrende stoffer forhøje vitellogeninproduktionen og herved også øgeaktiviteten i leveren (Rasmussen et al. 2002).

Hunners reproduktive kapacitet og ungers konditionsindeksBåde blandinger af miljøfarlige stoffer og enkeltstoffer forårsagede en højereandel hunner med mindsket reproduktiv kapacitet og/eller unger med lavt kondi-tionsindeks. Kun for TBT var dette ikke tilfældet. Der var ingen dosis-responssammenhæng, men en korrelation mellem lav reproduktiv kapacitet og KI forunger inden for hver behandling.CYP1A-aktivitetDen forhøjede CYP1A-aktivitet, dvs. en forhøjet mængde af CYP1A-enzymer ieksponerede fisk, kan være et resultat af behov for forøget nedbrydning af demiljøfarlige stoffer. Et øget niveau af CYP1A kan også skyldes, at enzymernebliver blokeret af stofferne, dvs. at mere enzym produceres, så CYP1A kan ud-føre dets normale funktioner, herunder nedbrydning af hormoner og vitaminer.Der kan også være tale om en kombination af de to muligheder. Der var ikkedirekte sammenhæng mellem aktivitet og eksponering for pyren og TCDD, hvil-ket peger på, at aktiviteten er et resultat af mange forskellige interaktioner bådeadditive som antagonistiske. Aktiviteten af CYP1A steg i løbet af forsøget, hvil-ket indikerer, at der er en forsinkelse mellem eksponering og effekt på CYP1A.CalciumDer var et signifikant fald i koncentrationen af plasmacalcium i hunner ekspone-ret for Dk50- og Dk+-blandingerne, men overraskende ikke i hunner eksponeretfor Dk50+-blandingen. I sidstnævnte var der dog til gengæld en tendens til laverekoncentrationer i ovarievæsken. Det vides ikke, om dette meget moderate fald icalciumtilgængelighed til ynglen kan bidrage til de observerede misdannelser.Også kobber reducerede mængden af calcium i blodet. Kobbers effekter påcalciumoptagelsen er ikke grundigt undersøgt, mens andre metaller såsomcadmium og bly er veldokumenterede konkurrenter (Craig et al. 2007). Dissemetaller bliver transporteret over gælle- eller tarmepithelet via calciumkanalerog hæmmer calciumoptagelsen, og det samme synes at gælde for kobber(Eyckmans et al. 2010). Fisk kan dog oftest kompensere efter en akut ekspone-ring som den i dette forsøg (McGeer et al. 2000, Eyckmans et al. 2010).Ud over direkte effekter på mekanismerne for iontransport kan kobber og andreforurenende stoffer påvirke de hormoner, som styrer ionbalancen (Kirk et al.2003, Suzuki et al. 2003, 2009, Eyckmans et al. 2010). Dette kan påvirke bådeoptagelse over epitheler og optagelse ind i celler og skelet samt påvirke mobili-seringen af skæl (Bjerregaard et al. 2001, Kirk et al. 2003, Suzuki et al. 2003,2009).

Dødelighed i forsøgetDødeligheden i de forskellige grupper lå mellem 30 og 54,5 %, og dødsfaldeneblandt forsøgsdyrene skete primært inden for de første tre uger efter forsøgs-start. Dødeligheden var ikke relateret til eksponeringen. Der er i tidligere labora-torieforsøg med ålekvabber fundet en lignende dødelighed (Mattsson et al.2001). I denne type forsøg, hvor der ikke er tid til egentlig akklimatisering til la-boratorieforholdene mellem indfangning og igangsættelse af eksponeringen,vurderes fiskene at være udsat for en højere grad af stress under forsøget endnormalt. Under mere normal akklimatisering vil det også være muligt at få sorteretde fisk fra, som måtte være skadede i ruserne under indfangningen.OvervejelserI forsøget blev fiskene kun udsat for en enkelt puls af kandidatstofferne via denintraperitonale injektion. Langtidseksponering via vandfasen eller gennem fødenville være mere miljørealistisk, idet denne eksponeringsform bedre simulererden kontinuerlige påvirkning fiskene, og hermed deres unger, udsættes for i mil-jøet.Vandeksponering er dog svær – hvis ikke umulig at administrere for så mangestoffer samtidigt, da nogle af de anvendte stoffer har en overordentlig lav oplø-selighed i vand. Eventuel eksponering via føden kræver, at fiskene først er såakklimatiserede til laboratorieforholdene, at de vil tage føde til sig. I vores forsøgskete dette først 2 uger inde i forsøget. Hvis eksponering skulle ske gennem fø-den, og man samtidig ønskede at ramme det følsomme vindue i ynglens udvik-ling, ville det være nødvendigt, at fiskene skulle indfanges og holdes i laborato-riet, før ægløsning og befrugtning havde fundet sted. Der var ikke på forhånderfaring med, om fiskene var villige til at parre sig i fangenskab, hvilket ville ha-ve gjort denne fremgangsmåde meget usikker.Mange af de anvendte stoffer er lipofile og kan under vitellogenesen videreføresfra en eksponeret moderfisk til blommesækkene i æggene og ophobes der. Enmiljørealistisk eksponering af fiskene under vitellogenesen ville derfor være re-levant. Desværre er der meget lidt erfaring med opdræt af ålekvabber i fangen-skab. Et lille sideløbende forsøg på feltstationen i Kerteminde tyder dog på, atdet er muligt at opbevare fiskene i længere tid og få dem til at få ægløsning ogparre sig. Hvis dette kunne kombineres med kontinuerlig eksponering gennemvandet eller føden, ville det også kunne fange det vindue, hvor embryonerne erallermest følsomme over for kemiske forstyrrelser.

Konklusionerne fra eksponeringsforsøget er, at:Der er en tendens til øget forekomst af misdannelser i ålekvabbeunger, nårde udsættes for såvel blandinger af miljøfarlige stoffer som enkelte miljøfar-lige stoffer i miljørelevante koncentrationer.Eksponeringen i forsøgene resulterede i koncentrationer af miljøfarlige stof-fer, som er på niveau med dem, som er fundet i miljøet.Frekvenser af misdannelser var også på niveau med dem, som er fundet imiljøet.Pyren og dioxinet TCDD var de enkeltstoffer, som forårsagede et forhøjetniveau af misdannelser af type B-G. Alle blandinger gav også forhøjede ni-veauer af type B-G, men i lavere grad end pyren alene. Samtlige enkeltstof-fer og blandinger medførte forhøjede niveauer af abnormt udviklede unger.Effekten af blandingen med lav koncentration af pyren, TBT og TCDD kanbeskrives som en additiv effekt af enkeltstofferne.For blandinger med højere koncentrationer er der ikke simple dosis-responssammenhænge, hvilket formenligt skyldes antagonistiske effekter af stof-blandinger.Der er generel tendens til mindsket reproduktiv kapacitet og lavere konditionaf unger i eksponerede fisk.Biomarkøren CYP1A-aktivitet var forhøjet i forhold til kontrollen med en tids-mæssig forsinkelse mellem eksponering og effekt. Også her var der tegn påantagonistiske effekter på CYP1A-systemet.

Det anbefales, at:1. Der gennemføres flere kontrollerede eksponeringsforsøg for at undersøgesammenhængen mellem eksponering for miljøfarlige stoffer og misdannel-ser i unger.2. I nye forsøg bør flere kombinationer af miljøfarlige stoffer inddrages, så in-teraktionseffekter bedre kan forstås. Derudover skal forsøgsgrupperne værestørre, der bør være mere tid til akklimatisering og eventuelt kan flere kan-didatstoffer inddrages. Ved nye forsøg bør eksponeringen af hunner skeogså inden befrugtning for at inddrage hele det teratogene vindue og helstgennem føde, så fiskene kan eksponeres for mange forskellige typer afstoffer samtidigt.3. Prøver fra FORMÅLs biobank gøres tilgængelige for andre forskningspro-jekter, hvor ålekvabben er i fokus, så komplementerende og opfølgendeanalyser kan fortages for at tilvejebringe et mere fyldigt billede af biomar-kørrespons.

Adema-Hannes, R., Shenker, J. 2008: Acute lethal and teratogenic effects oftributyltin chloride and copper chloride on Mahi mahi (Coryphaenahippurus)eggs and larvae. - Environmental Toxicology and Chemistry 27: 2131-2135.Alsop, D., Brown, S. & Van der Kraak, G. 2007:The effects of copper andbenzoapyrene on retinoids and reproduction in zebrafish. - Aquatic Toxi-cology 82: 281-295.Antkiewicz, D.S., Burns, C.G., Carney, S.A., Peterson, R.E. & Heideman, W.2005: Heart malformation is an early response to TCDD in embryonic Ze-brafish. - Toxicological Sciences 84: 368-377.Atli, G. & Canli, M. 2010: Response of antioxidant system of freshwater fishOreochromis niloticusto acute and chronic metal (Cd, Cu, Cr, ZN, Fe) ex-posure. - Ecotoxicology and Environmental Safety 73: 1884-1889.Bentivegna, C.S.& Piatkowski, T. 1998: Effects of tributyltin on medaka (Oryziaslatipes)embryos at different stages of development. - Aquatic Toxicology44: 117-128.Billiard, S.M., Meyer, J.N., Wassenberg, D.M., Hodson, P.V. & Di Giulio, R.T.2008. Nonadditive effects of PAHs on early vertebrate development:Mechanisms and implications for risk assessment. - Toxicological Sciences105: 5-23.Bjerregaard, H.F., Stærmose, S. & Vang, J. 2001: Effect of liniar alkylbenzenesulfonate (LAS) on ion transport and intracellular calcium in kidney distalepithelial cells (A6). - Toxicology in Vitro 15: 531-537.Bodammer, J.E. 1993: The teratological and pathological effects of contami-nants on embryonic and larvae fishes exposed as embryos: a review. - Am.Fish Soc. Symp. 14: 77-84.Carney, S.A., Prasch, A.L., Heideman, W. & Peterson, R.E., 2006. Understand-ing dioxin developmental toxicity using the zebrafish model. - Birth DefectsResearch A 76: 7-18.Celander, M., Nӓf, C., Broman, D. & Fӧrlin, L. 1994: Temporal aspects of induc-tion of hepatic cytochrome P4501A and conjugating enzymes in the vivipa-rous blenny (Zoarcesviviparous)treated with petroleum hydrocarbons. –Aquatic Toxicology 29: 183-196.Chairi, H., Fernández-Dias, C., Navas, J.I., Manchado, M., Rebordinos, L. &Blasco, J. 2010:In vivogenotoxicity and stress defences in three flatfishspecies exposed to CuSO4. - Ecotoxicology and Environmental Safety 73:1279-1285.

Christiansen, T., Korsgaard, B. & Jespersen, Å. 1998: Effect of nonylphenol and17β-oestradiol on vitellogenin synthesis, testicular structure and cytology inmale eelpoutZoarces viviparus.- The Journal of Experimental Biology 201:179-192.Craig, P.M., Wood, C.M. & McClelland, G.B. 2007: Oxidative stress responseand gene expression with acute copper exposure in zebrafish (Daniorerio).-American Journal of Physiology. Regulatory, Intergrative and ComparativePhysiology 293: R1882-R1892.Craig, P.M., Hogstrand, C., Wood, C.M. & McClelland, G.B. 2009: Gene ex-pression endpoints following chronic waterborne copper exposure in a ge-nomic model organism, the zebrafish,Danio rerio.- Physiological Geonomics40: 23-33.Dahllöf, I. & Strand J., 2010. Miljøfarlige stoffer i ålekvabbe – Delrapport I. By-og Landskabsstyrelsen (Naturstyrelsen). 38 pp. ISBN: 978-87-92708-21-2(PDF).Ekelund, R., Bergman, A., Granmo, A. & Berggren, M. 1990: Bioaccumulationof 4-nonylphenol in marine animals - a reevaluation. - Environmental Pollu-tion 64:107-120.Eriksen, M.S., Bakken, M., Espmark, Å., Braastad, B.O. & Salte, R. 2006:Prespawning stress in farmed Atlantic salmonSalmo salar:maternal corti-sol exposure and hypothermia during embryonic development affect off-spring survival, growth and incidence of malformations. - Journal of fishBiology 69: 114-129.Eyckmans, M., Tudorache, C., Darras, V. M., Blust, R. & de Boeck, G. 2010:Hormonal and ion regulatory response in three freshwater fish species fol-lowing waterborne copper exposure. - Comparative Biochemistry andPhysiology C 152: 270-278.Farwell, A., Nero, V., Croft, M., Bal, P. & Dixon, D.G. 2006: Modified JapaneseMedaka embryo-larval bioassay for rapid determination of developmentalabnormalities. - Archives of Environmental Contamination and Toxicology51: 600-607.Fent, K. 1991: Bioconcentration and elimination of tributyltin chloride by em-bryos and larvae of MinnowsPhoxinus phoxinus.- Aquatic Toxicology 20:147-157.Fent, K. 1996. Ecotoxicology of organotin compounds. - Critical Reviews inToxicology 26(1): 1-117.

Fent, K. & Meier, W. 1992: Tributyltin-induced effects on early life stages ofMinnowsPhoxinus phoxinus.- Archives of Environmental Contaminationand Toxicology 22: 428-438.Fent, K. & Meier, W. 1994: Effects of triphenyltin on fish early life stages. - Ar-chives of Environmental Contamination and Toxicology 27: 224-231.Garceau, N., Pichaud, N. & Couture, P. 2010. Inhibition of goldfish mitochon-drial metabolism byin vitroexposure to Cd, Cu and Ni. - Aquatic Toxicology98: 107-112.Gercken, J., Förlin, L. & Andersson, J. 2006: Developmental disorders in larvaeof eelpout (Zoarcesviviparous)from German and Swedish Baltic coastalwaters. - Marine Pollution Bulletin 53: 497-507.Giesy, J.P., Jones, P.D., Kannan, K., Newsted, J.L., Tillitt, D.E. & Williams, L.L2002: Effects of chronic dietary exposure to environmentally relevant con-centrations of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin on survival, growth, re-production and biochemical responses of female rainbow trout (Oncorhyn-chus mykiss).- Aquatic Toxicology 59: 35-53.Halling-Sørensen, B., Petersen, G., Stuer-Lauridsen, F., Slothuus, T., Kinnberg,K. & Bjerregaard, P. 2008: Kemiske stoffer der kan føre til misdannelser ifisk. Indkredsning af stoffer ud fra deres biokemiske virkemekanisme. Rap-port fra By- og Landskabsstyrelsen. 112 s.http://www2.blst.dk/udgiv/Publikationer/2008/978-87-92256-41-6/pdf/978-87-92256-42-3.pdf

Hamers, T., Kamstra J.H., Sonneveld, E., Murk, A.J., Kester, M.H.A., Anders-son, P.L., Legler, J. & Brouwer, A., 2006:In vitroprofiling of the endocrine-disrupting potency of brominated flame retardants. - Toxicological Sciences92: 157-173.Han, J. & Fang, Z. 2010: Estrogenic effects, reproductive impairment and de-velopmental toxicity in ovoviparous swordtail fish (Xiphophorushelleri)ex-posed to perfluorooctane sulfonate (PFOS). - Aquatic Toxicology 99: 218-290.Hannah, J.B., Hose, J.E., Landolt, M.L., Miller, B.S., Felton, S.P. & Iwaoka,W.T. 1982: Benzo(a)pyrene-induced morphologic and developmental ab-normalities in Rainbow trout. - Archives of Environmental Contaminationand Toxicology 11: 727-734.Hano, T., Oshima Y., Kim, S.G., Satone, H., Oba, Y., Kitano, T. Inoue, S., Shi-masaki, Y. & Honjo, T. 2007:Tributyltin causes abnormal development inembryos of medaka,Oryzias latipes.- Chemosphere 69: 927-933.

Hartl, M.G.J., Hutchinson, S. & Hawkins L.E. 2000: Reduced blood osmolarity infreshwater-adapted European O-group flounder,Platichtys flesus(L.), ex-posed to environmental levels of sediment-associated tributyl- andtriphenyltin.- Marine Pollution Bulletin 40: 792-794.Hoff, P.T., Van Dongen, W., Esmans, E.L., Blust, R. & De Coen, W.M. 2003:Evaluation of the toxicological effects of perfluooctane sulfonic acid in thecommon carp (Cyprinuscarpio).- Aquatic Toxicology 62: 349-359.Hose, J.E., Hannah, J.B., Di Julio, D., Landolt, M.L., Miller, B.S., Iwaoka, W.T. &Felton, S.P. 1982: Effects of Benzo(a)pyrene on early development of flat-fish. - Archives of Environmental Contamination and Toxicology 11: 167-171.Incardona, J.P., Collier, T.K. & Scholz, N.L. 2004: Defects in cardia functionprecede morphological abnormalities in fish embryos exposed to polycyclicaromatic hydrocarbons. - Toxicology and Applied Pharmacology 196: 191-205.Incardona, J.P., Day, H.L., Collier, T.K. & Scholz, N.L. 2006: Developmentaltoxicity of 4-ring polycyclic aromatic hydrocarbons in zebrafish is differen-tially dependent on AH receptor isoforms and hepatic cytochrome P4501Ametabolism. - Toxicology and Applied Pharmacology 217: 308-321.Ishibashi, H., Hirano, M., Matsumura, N., Watanabe, N., Takao, Y. & Arizono, K.2006: Reproductive effects and bioconcentration of 4-nonylphenol inmedaka fish (Oryziaslatipes).- Chemosphere 65: 1019-1026.Johnson, A, Carew, E. & Sloman, K.A. 2007: The effects of copper on the mor-phological and functional development of zebrafish embryos. - AquaticToxicology 84: 431-438.Kammann, U., Vobach, M. & Wosniok, W. 2006: Toxic effects of brominated in-doles and phenols on Zebrafish embryos. - Archives of Environmental Con-tamination and Toxicology 51: 97-102.Kammann U. 2010. PAH-Metabolite Intercalibration 2010, Bonus+-ProjectBEAST, 11ppKelly, S.A. & di Giulio R.T. 2000: Developmental toxicity of estrogenic alkylphe-nols in Killifish (Fundulusheteroclitus).- Environmental Toxicology andChemistry 19: 2564-2570.Kirk, C.J., Bottomley, L., Minican, N., Carpenter, H., Shaw, S., Kohli, N., Winter,M., Taylor E.W., Waring, R.H., Michelangeli, F. & Harris, R.M. 2003: Envi-ronmental endocrine disrupters dysregulate estrogen metabolism and Ca2+homeostasis in fish and mammals via receptor-independent mechanisms. -Comparative Biochemistry and Physiology A 135: 1-8.

Kling, P., Norman, A., Andersson, P.L., Norrgren, L. & Förlin, L. 2008: Gender-specific proteomic responses in zebrafish liver following exposure to a se-lected mixture of bromated flame retardants. - Ecotoxicology and Environ-mental Safety 71: 319-327.Lema, S.C., Schultz, I.R., Scholz, N.L., Incardona, J.P. & Swanson, P. 2007:Neural defects and cardiac arrhythmia in fish larvae following embryonicexposure to 2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether (PBDE 47). - Aquatic Toxi-cology 82: 296-307.Liu, C., Yu, K., Shi, X., Wang, J., Lam, P.K.S., Wu, R.S.S. & Zhou, B. 2007. In-duction of oxidative stress and apoptosis by PFOS and PFOA in primarycultured hepatocytes of freshwater tilapia (Oreochromisniloticus).- AquaticToxicology 82: 135-143.Manson, J.M. & Wise, L.D. 1991: Tetragens. - In: Amdur, M.O., Doull, J.D. &Klaassen, C.D. (eds.): Casarett and Doull’s Toxicology: The Basic scienceof poisons. Mc-Graw-Hill, New York, pp. 226-254.Maradonna, F., Polzonetti, V., Bandiera, S.M., Migliarini, B. & Carnevali O.2004: Modulation of the hepatic CYP1A1 system in the marine fishGobiusniger,exposed to xenobiotic compounds. - Environmental Science andTechnology 38: 6277-6282.Mattsson, K., Tana, J., Engstrom, C., Hemming, J. & Lehtinen, K.J. 2001: Ef-fects of wood-related sterols on the offspring of the viviparous blenny,Zoarces viviparusL. - Ecotoxiclogy and Environmental Safety 49:122-130.McGeer, J.C., Szebedinszky, C., McDonald, D.G. & Wood, C.M. 2000: Effectsof chronic sublethal exposure to waterborne Cu, Cd or Zn in rainbow trout.1: Iono-regulatory disturbance and metabolic costs. - Aquatic Toxicology 50:231-243.Meucci, V. & Arukwe, A. 2006: The xenoestrogen 4-nonylphenol modulates he-patic gene expression of pregnane X receptor, aryl hydrocarbon receptor,CYP3A and CYP1A1 in juvenile Atlantic salmon (Salmosalar).- Compara-tive Biochemistry and Physiology C 142: 142-150.Micael, J., Reis-Henriques, M.A., Carvalho, A.P. & Santos M.M. 2007:Genotoxic effects of binary mixtures of xenoandrogens (tributyltin,triphenyltin) and a xenoestrogen (ethinylestradiol) in a partial life-cycle testwith Zebrafish (Daniorerio).-Environment International 33: 1035-1039.

Morcillo, Y., Janer, G., O’Hara, S.C.M., Livingstone, D.R. & Porte, C. 2004: In-teraction of tributyltin with hepatic cytochrome P450 and Uridine diphos-phate-glucuronosyl transferase systems of fish:in vitrostudies. - Environ-mental Toxicology and Chemistry 23 (4): 990-996.Mortensen, A.S. & Arukwe, A. 2007: Modulation of xenobiotic biotransformationsystem and hormonal responses in Atlantic salmon (Salmosalar)after ex-posure to tributyltin (TBT). - Comparative Biochemistry and Physiology C145: 431-441.Mortensen, A.S. & Arukwe, A. 2009: Effects of Tributyltin (TBT) onin vitrohor-monal and biotransformation responses in Atlantic salmon (Salmosalar).-Journal of Toxicology and Environmental Health A 72: 209-218.Nakayama, K., Oshima, Y., Nagafuchi, K., Hano, T., Shimasaki, Y. & Honjo, T.2005: Early-life-stage toxicity in offspring from exposed parent Medaka,Oryzias latipes,to mixtures of tributyltin and polychlorinated biphenyls. -Environmental Toxicology and Chemistry 24: 591-596.Oakes, K.D., Sibley, P.K., Martin, J.W., MacLean, D.D., Solomon, K.R., Mabury,S.A. & Van der Kraak, G.J. 2005: Short-term exposures of fish to per-fluorooctane sulfonate: Acute effects on fatty acyl-CoA oxidase activity, oxi-dative stress, and circulating sex steroids. - Environmental Toxicology andChemistry 24: 1172-1181.Ohji, M., Arai, T. & Miyazaki, N. 2006:Transfer of tributyltin from parental femaleto offspring in the viviparous surfperchDitrema temmincki.- Marine EcologyProgress Series 307: 307-310.Pedersen, B., Larsen, M.M. & Dahllöf, I. 2004a: Teknisk anvisning for marinovervågning. 4.4 Miljøfarlige stoffer i muslinger. Danmarks Miljøun-dersøgelser. - Teknisk anvisning fra DMU’s Marine Fagdatacenter. 19 s.http://www.dmu.dk/myndighedsbetjening/overvaagning/fagdatacentre/fdcmarint/tekniskeanvisningernovana20042009/

Rasmussen, T.H., Andreassen, T.K., Pedersen, S.N., Van der Ven, L.T.M.,Bjerregaard, P. & Korsgaard, B. 2002: Effects of waterborne exposure ofoctylphenol and oestrogen on pregnant viviparous eelpout (Zoarcesvivipa-rus)and her embryosin ovario.- The Journal of Experimental Biology 205:3857-3876.Rattfelt Nyholm, J., Norman, A., Norrgren, L., Haglund, P. & Andersson, P.L.2008: Maternal transfer of brominated flame retardants in zebrafish (Daniorerio).- Chemosphere 73: 203-208.Ronisz, D., Larsson, D.G.J. & Förlin, L. 1999: Seasonal variations in the activi-ties of selected hepatic biotransformation and antioxidant enzymes in eel-pout (Zoarcesviviparus).- Comparative biochemistry and physiology C 124:271-279.Santos, E.M., Ball, J.S., Williams, T.D., Wu, H., Ortega, F., van Aerle, R.,Katsiadaki, I., Falciani, F., Viant, M.R., Chipman, J.K. & Tyler, C.R. 2010:Identifying health impacts of exposure to copper using transcriptomics andmetabolomics in a fish model. - Environmental Science and Technology 44:820-826.Selwyn, M.J. 1976: Triorganotin compounds as ionophores and inhibitors of iontranslocating ATPase. - In: Organotin compounds: New chemistry and ap-plications, Zuckerman, J.J., American Chemical Society, Washington D.C.Sharpe, R.L., Benskin, J.P., Laarman, A.H., MacLeod, S.L., Martin, J.W., Wong,C.S. & Goss, G.G. 2010: Perfluorooctane sulfonate toxicity, isomer-specificaccumulation, and maternal transfer in Zebrafish (Daniorerio)and Rainbowtrout (Onchorhynchusmykiss).- Environmental Toxicology and Chemistry29: 1957-1966.Shi, X., Du, Y., Lam, P.K.S, Wu, R.S.S. & Zhou, B. 2008: Developmental toxicityand alteration of gene expression in zebrafish embryos exposed to PFOS. -Toxicology and Applied Pharmacology 230: 23-32.Shi, X., Liu, C., Wu, G. & Zhou, B. 2009: Waterborne exposure to PFOS causesdisruption of the hypothalamus-pituitary-thyroid axis in zebrafish larvae. -Chemosphere 77: 1010-1018.Stagg, R. & McIntosh, A. 1998: Biological effects of contaminants: Determina-tion of CYP1A-dependent mono-oxygenase activity in dab by fluorimetricmeasurement of EROD activity. - ICES Techniques in Marine Environ-mental Sciences No. 23, 16 pp.

Stouthart, X.J.H.X., Haans, L.M., Lock, R.A.C. & Wendelaar Bonga, S.E. 1996:Effects of water pH on copper toxicity to early life stages of the commoncarp (Cyprinuscarpio).– Environmental toxicology and Chemistry 15: 376-383.Strand, J., Andersen, L., Dahllöf, I. & Korsgaard, B. 2004. Impaired larval devel-opment in broods of eelpout (Zoarcesviviparus)in Danish coastal waters. -Fish Physiology and Biochemistry 30: 37-46.Strand, J. & Dahllöf, I. 2005: Teknisk anvisning for marin overvågning. 4.5Biologisk effektmonitering - muslinger. NOVANA. Danmarks Miljøun-dersøgelser. - Teknisk anvisning fra DMU's Marine Fagdatacenter. 15 s.Stuer-Lauridsen, F., Gustavson, K., Møhlenberg, F., Dahllöf, I., Strand, J., Bjer-regaard, P., Korsgaard, B., Rasmussen, T.H. & Halling-Sørensen, B. 2008:Misdannet ålekvabbeunger og andre biologiske effekter i danske vandom-råder. Litteraturudredning. Miljøministeriet, By- og Landskabsstyrelsen. -Miljøprojekt 1151, 208 s.http://www2.blst.dk/udgiv/Publikationer/2008/978-87-7052-384-4/html/default.htm

Sturve, J., Berglund, Å., Balk, L., Broeg, K., Bӧhmert, B. & Massey, S. 2005: Ef-fects of dredging in Gӧteborg Harbor, Sweden, assessed by biomarkers ineelpout (Zoarcesviviparous).- Environmental Toxicology and Chemistry 24:1951-1961.Suzuki, N., Kambegawa, A. & Hattori, A. 2003: Bisphenol A influences theplasma calcium level and inhibits calcitonin secretion in Goldfish. - Zoologicalscience 20: 745-748.Suzuki, N., Hayakawa, K., Kameda, T., Triba, A., Tang, N., Tabata, M.J., Takada,K., Wada, S., Omori, K., Srivastav, A.K., Mishima, H. & Hattori, A. 2009:Monohydroxylated polycyclic aromatic hydrocarbons inhibit both osteoclasticand osteoblastic activities in teleost scales. - Life sciences 84: 482-488.Tjärnlund, U., Ericson, G., Örn, U., de Wit, C. & Balk, L. 1998: Effects of twopolybrominated diphenyl ethers on Rainbow trout (Onchorhynchusmykiss)exposed via food. - Marine Environmental Research 46: 107-112.Vetemaa, M., Förlin, L. & Sandström, O. 1997: Chemical industry effluent im-pacts on reproduction and biochemistry in a North Sea population of vivipa-rous blenny (Zoarcesviviparous).- Journal of Aquatic Ecosystem Stressand Recovery 6: 33-41.de Wit, C.A. 2002. An overview of brominated flame retardants in the environ-ment. - Chemosphere 46: 583-624.

Witeska, M., Bilska, K. & Sarnowski, P. 2010: Effects of copper and cadmiumon growth and yolk utilization in Barbel (BarbusbarbusL.) larvae. - PolishJournal of Environmental Studies 19: 227-230.Yamauchi, M., Kim, E.-Y., Iwata, H., Shima, Y. & Tanabe, S. 2006: Toxic effectsof 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) in developing red seabream(Pagrusmajor)embryo: An association of morphological deformities withAHR1, AHR2 og CYP1A expressions. - Aquatic Toxicology 80: 166-179.Zhang, F.-X., Xu, Y. & Hui, Y. 2006 : Reproduktive effects of prenatal exposureto nonylphenol on zebrafish (Daniorerio).- Comparative Biochemistry andPhysiology C 143: 77-84.Zhang, X., Yang, F. Cai, Y.Q. & Xu, Y. 2008: Oxidativ damage in unfertilizedeggs of Chinese rara minnow (Gobiocyprisrarus)exposed to nonylphenol. -Environmental Toxicology and Chemistry 27 (1): 213-219.