MPU, Alm.del - 2010-11 (1. samling) - Bilag 344: Rapport om undersøgelser af misdannede ålekvabber, fra miljøministeren

Biomarkører i ålekvabbe - Delrapport IIBiomarkører målt i ålekvabbe blev sammenholdt med forekomsten af mis-dannede ålekvabbeunger.Ålekvabbe fra områder med misdannelser havde lavere vitamin A, B og E niveauer, højereCYP1A-aktivitet og større forekomst af PAH-metabolliter. Hormonbalancen var også påvirket,men kobling til mis-dannelser er uklar.Jakob Strand & Ingela Dahllöf, Danmarks Miljøundersøgelser, Aarhus UniversitetPoul Bjerregaard, Kim Gustavson, Jette Jacobsen, Gitte Petersen, Zhanna TairovaÅlekvabbe, biomarkører, Vitamin A, B, E, PAH-metabolliter, CYP1A, steroider, lipid, LSI

www.blst.dk978-87-92708-22-9 (PDF-udgave)By- og LandskabsstyrelsenStatslig2010DanskMå citeres med kildeangivelse.By- og landskabstyrelsen, MiljøministerietBy- og Landsskabsstyrelsen vil, når lejligheden gives, offentliggøre rapporter inden formiljøsektoren, finansieret af By- og Landskabsstyrelsen. Det skal bemærkes, at en sådanoffentliggørelse ikke nødvendigvis betyder, at det pågældende indlæg giver udtryk forBy- og Landskabsstyrelsens synspunkter. Offentliggørelsen betyder imidlertid, at By- ogLandskabsstyrelsen finder, at indholdet udgør et væsentligt indlæg i debatten omkringden danske miljøpolitik

Forord............................................................................................................. 5Sammenfatning .............................................................................................. 7Summary ........................................................................................................ 9Introduktion................................................................................................... 11Forekomsten af fejludviklede ålekvabbeunger i 2009 .............................. 13Indsamling og prøvetagning ......................................................................... 17Udvalgte lokaliteter ................................................................................... 17Prøveindsamling ....................................................................................... 17Resultater ..................................................................................................... 21Vitamin A, E og B i æg og unger .............................................................. 21Steroider i blod og ovarievæske fra voksne hunner ................................. 24CYP1A-aktivitet i lever fra voksne hunner ................................................ 26PAH-metabolitter i galde fra voksne hunner ............................................. 27Lipid i muskel fra voksne hunner samt æg og unger ................................ 28Diskussion .................................................................................................... 31Konklusioner og anbefalinger....................................................................... 37Referencer.................................................................................................... 39

I forbindelse med den nationale overvågning af vandmiljøet (NOVANA) i årene2004-2008 er der fundet forhøjede forekomster af misdannede unger i kuld frafisken ålekvabbe i en række danske fjorde. I andre lande, herunder Tyskland ogSverige, er der gjort lignende fund af misdannede ålekvabbeunger.Der er tidligere blevet gennemført to litteraturstudier i regi af Miljøministeriet,hvilke er afrapporteret i: 1) Misdannet ålekvabbeunger og andre biologiske ef-fekter i danske vandområder. Litteraturudredning (Stuer-Lauridsen et al. 2008),og 2) Kemiske stoffer der kan føre til misdannelser i fisk. Indkredsning af stofferud fra deres biokemiske virkemekanisme (Halling-Sørensen et al. 2008).Konklusionerne fra disse udredninger var, at ålekvabbeunger med misdannelserer hyppigst forekommende i kystnære områder med menneskelig aktivitet, og atder er mistanke om, at fx klorerede organiske forbindelser, TBT, PAH, pestici-der, tungmetaller, lægemidler og stoffer med hormonforstyrrende effekter er år-sagen til fund af misdannelser, evt. ved additiv virkning fra flere stoffer.FORMÅL-projektet (’Et undersøgelsesforløb til atFORklarefund afMisdannedeÅLekvabbeungeri danske fjorde’) er en del af Miljøministeriets tilvejebringelseaf viden, der er nødvendig, for at By- og Landskabsstyrelsen kan opstille evt.forslag til indsatser, der kan imødegå biologiske effekter i miljøet.FORMÅL-projektet består af tre trin:1. Et måleprogram, der kan tilvejebringe et fyldestgørende billede af vandmil-jøets tilstand med hensyn til miljøfarlige stoffer for at indkredse årsagen tilfund af misdannelser i ålekvabbeunger.2. Laboratorieforsøg til etablering af viden om effektniveauer for udvalgte ke-miske stoffer i ålekvabber.3. En tværgående analyse af de gennemførte aktiviteter og resultater fra an-dre projekter, der sammenfatter viden om årsager til forekomst og udbre-delse af effekter og misdannelser i ålekvabber.De overordnede resultater og konklusioner fra trin 1 er sammenfattet i Miljøfarligestoffer og ålekvabbe – et feltstudie. Trin 1.Denne delrapport er den anden af tre, hvor resultaterne fra FORMÅLs første trinrapporteres, og omhandler biomarkører i ålekvabbe. De andre to delrapporteromhandler: I) Miljøfarlige stoffer i ålekvabbe samt III) Miljøfarlige stoffer i sedi-ment og bundfauna.

Biomarkører kan anvendes til at vurdere biologiske årsager og virkemekanismerbag fundene af forhøjede forekomster af misdannede unger i kuld fra fiskenålekvabbe.De i denne sammenhæng anvendte biomarkører omfatter vitaminerne A, E ogB, steroider, CYP1A, PAH-metabolitter og lipid. Responsniveauet af disse bio-markører i ålekvabber er undersøgt ved tre lokaliteter i 2009; ved Agersø i Sto-rebælt, der er udvalgt som referencestation, og ved Roskilde og Frederiksværk,hvor der gennem en årrække har været en forhøjet forekomst af misdannedeålekvabbeunger. Prøvetagningen er forløbet over tre perioder i august, septem-ber og november, som repræsenterer forskellige vigtige trin i ålekvabbers udvik-lingen fra æg til unger.Undersøgelsen viste, at responsniveauet for flere af biomarkørerne i ålekvabbeved Roskilde og Frederiksværk generelt adskiller sig fra referencestationen vedAgersø. Dette gælder for niveauerne af vitaminer og steroider, CYP1A, og PAH-metabolitter. Hvilke det drejer sig om, og i hvilket omfang, afhænger dels af denenkelte biomarkør, dels af tidspunktet.Der er indikationer på, at årsagen til den øgede forekomst af ålekvabbekuldmed misdannede unger ved Roskilde og Frederiksværk kunne relateres til lave-re niveauer af vitamin A, E og B. For vitamin E, som bl.a. beskytter mod oxidativstress, var det tilfældet både i august og i november. De laveste niveauer af vi-tamin A fandtes gennemgående ved Frederiksværk og de lavest niveauer af vi-tamin B blev fundet ved Roskilde. Dette kan skyldes tilstedeværelse af forskelli-ge typer af miljøfarlige stoffer. Tilsvarende adskiller CYP1A-aktiviteten i leverenog niveauet af PAH-metabolitter i galde fra de gravide hunner sig især i augustved Roskilde og Frederiksværk i forhold til Agersø. Dette styrker formodningenom, at de lavere vitaminniveauer var forårsaget af en øget belastning med vissegrupper af miljøfarlige stoffer, og ikke forskelle i andre biotiske og abiotiske for-hold.Konklusionerne fra måleprogrammet er, at:•

Biomarkers can be used to assess what biological mechanisms that are af-fected by hazardous substances and result in the observed deformities in eel-pout larvae.The biomarkers used in this study were content of vitamin A, E and B, steroids,PAH-metabolites and lipid, as well as CYP1A activity in eelpout. Eelpout werecaught at three sites in August, September and November. Agersø in theSouthern Belt Sea was considered a reference site, as no deformities were ob-served here either in September or November. Roskilde and Frederiksværk,both situated in Roskilde Fjord, were impacted sites where more than 5 % of thebroods had more than 5 % deformities.The responses of many of the biomarkers were different at the impacted sitescompared to the reference site, especially for the vitamins, steroids, CYP1A andPAH-metabolites. The difference between sites varied both in time and magni-tude for most of the biomarkers.There are indications that the cause of deformities could be related to lower lev-els of vitamin A, E and B. For vitamin E that protects against oxidative stressthe levels were lower at the impacted sites both in August and November. Thelowest levels of vitamin A were found at Frederiksværk, and the lowest levels ofvitamin B were found at Roskilde. These differences could be caused by differ-ences in contamination profile between the sites. The activity of CYP1A andlevels of PAH-metabolites were higher at the sites with deformities, especially inAugust. This strengthens the notion that the lower levels of vitamins at the siteswith deformed larvae were caused by increased pressure from hazardous sub-stances, and not by other differences in abiotic and biotic conditions at the sitessuch as difference in prey.The conclusions from this study are that:•••the levels of vitamin A, B and E, as well as CYP1A-activitycan becorrelatedwithoccurrence of deformities,PAH-metabolites show differences in PAH-exposure that is also connectedto occurrence of deformities,more background knowledge of the hormone balance in connection with de-formities in eelpout is needed before a more conclusive interpretation of thedifferent responses for steroids can be made.

Biomarkører er biologiske indikatorer, der kan anvendes til at vurdere, om miljø-farlige stoffer påvirker og derved udgør en risiko for dyrelivet i vore farvande.Biomarkører anvendes til at identificere tidlige tegn på skadelige effekter i indivi-der, bl.a. i det Nationale Overvågningsprogram for Naturen og Vandmiljøet(NOVANA). De tidlige tegn på effekter har dog ikke nødvendigvis betydning påpopulationsniveau. Mange biomarkører kan anvendes som indikatorer for atvurdere både de rumlige, dvs. mellem områder, og tidslige variationer i re-sponsniveauet, som kan være forårsaget af miljøfarlige stoffer. Nogle biomarkø-rer er stofspecifikke, fx imposex og intersex som indikatorer for effekter af stof-fet TBT i havsnegle (OSPAR 1998a; Strand et al. 2009). Andre biomarkører an-ses derimod som værende mere generelle stressmarkører for den samlede på-virkning af de ofte komplekse blandinger af de mange forskellige miljøfarligestoffer, der kan forekomme i havmiljøet (OSPAR 1998b).Afhængig af typen af biomarkør kan de forskellige typer af effekter komme tiludtryk med en forsinkelse i forhold til det reelle tidspunkt, hvor påvirkningenfandt sted. Derfor kan det ikke altid forventes, at responsniveauet for alle typer afbiomarkører viser de samme billeder af påvirkningsgrad. Det er nødvendigt atinddrage viden om koncentrationsniveauer af potentielt skadelige miljøfarligestoffer og deres virkemekanismer, når uønskede effekter på dyrelivet observe-res i miljøet, og årsagerne dertil skal indkredses. Ofte vil det endvidere værenødvendigt at inddrage forskellige supplerende biomarkører for at styrke afkla-ringen af de bagvedliggende biologiske årsager og virkemekanismer(ICES/OSPAR 2008). Forekomsten af misdannelser i fisk som ålekvabbe er eteksempel på en generel biomarkør, hvor det vil være nødvendigt med yderlige-re undersøgelser af både de kemiske og biologiske forhold for at sandsynliggø-re årsagerne.Det overordnede formål med undersøgelsesforløbet i FORMÅL-projektet varderfor at klargøre årsagen til observerede områdemæssige forskelle i forekom-sten af misdannede unger i kuld fra den levendefødende fisk ålekvabbe (Zoar-ces viviparus)i det danske vandmiljø (Strand et al. 2004; Strand 2009). Hypote-sen var, at de lokalt øgede forekomster af misdannede unger i kuld fra ålekvab-ber er forårsaget af forurening med miljøfarlige stoffer, da det er sandsynliggjort,at en række miljøfarlige stoffer, der forekommer i det danske vandmiljø, kanmedføre toksiske effekter, som kan lede til bl.a. misdannelser i fisk (Stuer-Lauridsen et al. 2008; Halling-Sørensen et al. 2008).Test af hypotesen og opfyldelse af det overordnede formål vil forudsætte kend-skab til både miljøets og de voksne ålekvabbers samt ungers belastning medmiljøfarlige stoffer og sammenholdelse med effektniveauet i ålekvabber beskre-

Resultaterne fra undersøgelserne af forekomsten af forskellige grupper af miljø-farlige stoffer i ålekvabbe og deres unger samt i miljøet, dvs. sediment og mus-linger ved de tre udvalgte undersøgelseslokaliteter, gennemgås i to andre selv-stændige delrapporter, delrapport I og delrapport III.I denne undersøgelse blev der valgt lokaliteter ved Roskilde og Frederiksværk ihhv. den sydlige og nordlige del af Roskilde Fjord-systemet, hvor tidligere un-dersøgelser i forbindelse med NOVANA-overvågningen har vist forhøjet fore-komst af misdannede ålekvabbeunger (Strand et al. 2004; Stuer-Lauridsen etal. 2008). Derudover vurderes populationerne her også at være store nok til atfå et tilstrækkeligt antal fisk indsamlet, og kontamineringsprofilen med miljøfarligestoffer vurderes at være forskellig mellem de to områder. Som referencestationblev udvalgt området ved Agersø i Storebælt, da den betragtes som den gene-relt mindst belastede station med større vandudveksling end på de andre stati-oner. Stationerne i Roskilde Fjord er placeret tæt på større byer og i mere afluk-kede fjordområder med lavere vandudveksling.Undersøgelsen omfattede en udvidet prøvetagning af ålekvabber i forhold tilden normale NOVANA-prøvetagning i november, idet indsamlingen forløb overtre perioder i august, september og november 2009. Indsamlingen af ålekvab-ber mislykkedes dog ved Agersø i september.I august var æggene lige blevet befrugtet, men der var endnu ingen decideretembryon- eller ungeudvikling. Derimod var ungeudviklingen i fuld gang ved prø-vetagningen i september (middellængde 21,5 � 2,3 mm) og november (middel-længde 30,7 � 2,7 mm), og ungerne kunne derfor til disse tidspunkter undersø-ges for forekomsten af misdannelser og andre typer af fejludvikling.

Karakterisering af unormal udvikling hos ålekvabbeunger består af 10 typer affejludviklede unger, som beskrevet i den tekniske anvisning for NOVANA(Strand & Dahllöf 2005) og sammenstillet itabel 1.Tabel 1. Karakterisering af forskellige typer af fejludviklede unger i kuld fraålekvabbe, efter Strand & Dahllöf 2005.0ABCDEFGHIBefrugtede æg eller embryo, der lige er klækket (< 10 mm)Dødt unger uden misdannelser, < 10 mmUnger med misdannelser i blommesæk eller indvoldeUnger med ’vinkelknæk’ på rygradUnger med spiralformet rygradUnger med defekt på øjne eller manglende øjneUnger med misdannelser i hovedetTo sammenvoksede unger, evt. som siamesisk tvillingAndre abnormiteter, evt. som kalcificeret unger eller sammenfiltrede klyngerSignifikant mindre unger, ’dværgvækst’

Forekomsten af fejludviklede ålekvabbeunger i 2009Undersøgelserne i 2009 viste, at ligesom tidligere år var der en forhøjet fore-komst af misdannede unger i ålekvabbernes kuld på lokaliteterne ved Roskildeog Frederiksværk.Ved Roskilde havde 5,0 % og 8,2 % af ålekvabberne i hhv. september og no-vember en øget forekomst, dvs. mere end 5 % af misdannede unger (type B-G)i de enkelte kuld. Ved Frederiksværk var andelen af kuld med øget forekomst afmisdannede unger oppe på 9,5 % og 10,0 % i hhv. september og november.Derimod havde ingen af de undersøgte kuld ved referencestationen Agersø inovember mere end 5 % misdannede unger (figur1).Desuden var Roskilde og Frederiksværk i 2009 de to områder, hvor der var denhøjeste forekomst af ålekvabber med mere end 5 % af de andre typer af fejlud-viklede unger i kuldene, hhv. tidligt døde unger (type 0) og sent døde unger (typeA) (figur1).

Efter indsamlingen blev fiskene transporteret til Risø i Roskilde Fjord, hvor fi-skene blev opbevaret maksimalt 24 timer i aflukkede trådbure frem til dissektionog udtagning af prøver til de forskellige delundersøgelser (tabel3).Følgendebiometriske mål blev taget på alle fisk: længde, totalvægt, vægt uden indvolde(somatisk vægt), vægt af lever, vægt af gonade (dvs. kuld hos hunner eller te-stikler hos hanner), antal unger i kuld, antal, længdefordeling og type af mis-dannede unger og anden type af fejludvikling i henhold til NOVANA teknisk an-visning (Strand & Dahllöf 2005), se også Annex 1,tabel 3.Vævsprøver blev udtaget ved dissektion umiddelbart efter, at de voksne fisk varblevet aflivet med kraftige slag i hovedet. Først blev blod og lever udtaget, der-på æg eller unger og efterfølgende de andre vævsprøver. De udtagne prøverfra november skulle, udover at anvendes til de i dette projekt udvalgte analyserfor biomarkører og miljøfarlige stoffer, også anvendes til andre supplerende un-dersøgelser i forbindelse med BONUS+-projekterne BALCOFISH og BEAST.Dette indebar, at flere af vævsprøverne blev opdelt i flere delprøver, fx lever ogmuskel der blev opdelt i henholdsvis 7 og 4 delprøver. Prøver fra august ogseptember blev udelukkende anvendt i forbindelse med dette FORMÅL-projekt.Alle delprøver blev registeret og opbevaret separat i en biobank, så senereidentifikation og analyser af individbaserede prøver kunne gennemføres.Prøver af æg fra august og unger fra september og november blev anvendt tilanalyse af vitaminer A, E og B. I august, hvor æggene lige var blevet befrugtet,blev hele ovariet dissekeret ud og vejet og derpå frosset ned med tøris i glas-vials. I september og november, hvor ungeudviklingen var i fuld gang, blev kul-det først vejet, ungerne talt, undersøgt for fejludviklede unger og længdeforde-lingen målt (middellængde i september: 21,5 � 2,3 mm og november: 30,7 � 2,7mm), før de blev frosset ned med tøris i glasvials.18

Ovarievæske til steroidanalyser blev i september og november frasigtet ungerne,før den videre undersøgelse af dem. Ovarievæsken blev frosset ned i glasvialspå tøris.Prøver af blod på 0,5-1 ml til steroidanalyser blev udtaget med heparin-coatet 1ml sprøjte med kanyle. Plasma blev udtaget og frosset ned på tøris efter centri-fugering i Eppendorfrør ved 2.500 rpm i 5 minutter.Af leveren blev kun den yderste del af højre halvdel anvendt til analyse afCYP1A, som blev frosset ned i cryorør i flydende nitrogen. Leverprøver til ana-lyse for miljøfarlige stoffer blev opbevaret i glasvials og frosset ned ved -20�C.Prøver af galde til undersøgelse af PAH-metabolitter og muskelprøver til analy-se for miljøfarlige stoffer og lipid blev frosset ned ved -20�C i henholdsvis Ep-pendorfrør og rilsanposer.Prøver af lever og galde til analyse for CYP1A-aktivitet og PAH-metabolitterblev taget fra de 20 mest friskfangede fisk, der maksimalt havde været opbeva-ret i 24 timer efter fangsttidspunktet. De resterende fisk, der indgik i undersø-gelsen af reproduktiv succes og herunder undersøgelse af forekomst af mis-dannede unger i kuldene, blev maksimalt opbevaret i trådbure i 3 dage.Tabel 3. Oversigt over de undersøgte biomarkører, udvalgt matrice, opbevaringsforholdog analysemetode.Opbevaring afBiomarkørBiometri ogreproduktionVitamin A og EVitamin BSteroiderCYP1A / EROD-aktivitetPAH-metabolitterLipidGalde fra voksne hunnerMuskel fra voksne hunner-20�C-20�CHele kuld, æg eller ungerHele kuld, æg eller ungerBlod eller ovarievæske fravoksne hunnerLever fra voksne hunner-80�CSpektrofotometriskenzymkinetikFluorescens ogHPLCEkstraktionMatriceVoksne gravide hunnerprøverUndersøgtlevende-80�C-80�C-80�CAnalysemetodeLængde, vægt,antalLC-MSLC-MSLC-MS

der kunne opnå tilstrækkelige detektionsgrænser, som vil være relevante foranalyser af biologisk materiale fra fisk. Vitamin B blev prioriteret frem for bl.a.thyroidhormoner pga. manglende muligheder for at udføre kvalitetssikrede ana-lyser. Selenanalyser på blod blev ikke udført, da der ikke var en tilstrækkeligprøvemængde fra de sammen individer tilbage efter de udførte steroidanalyser.Vitaminer og steroider blev analyseret i augustprøverne, hvor der endnu ikkekunne undersøges misdannelser, i 6 individer udvalgt fra de 20 hunner, hvorder også blev analyseret for PAH-metabolitter og CYP1A. Steroider blev målt iblod, eftersom der ikke er ovarievæske i august. I prøverne fra september ognovember blev der analyseret for vitaminer og steroider i udvalgte individer,hvor der dels forekom > 5 % misdannelser B-G per kuld (maks. 5 per station) ogdels ingen misdannelser. I de tilfælde hvor der ikke var 5 kuld med høj frekvensaf misdannelser, blev der udvalgt individer med den højeste grad af misdannel-ser (B-G).I alt blev 68 prøver udvalgt til analyse for vitamin A, B og E, samt for steroider(progestagener, glucocortikoider, androgener og østrogener), og 100 prøver tilanalyse for CYP1A (inkl. protein) og PAH-metabolitter. At der ikke er et kompletsammenfald på individniveau, skyldes at det ikke var muligt at få tilstrækkeligprøvemængde fra samtlige fisk.Lipidanalyser blev udført på de samme prøver som anvendes til analyser formiljøfarlige stoffer, se delrapport I.

Vitamin A, E og B i æg og ungerEn række forskellige vitaminer har betydning for udvikling af fiskeæg og den vi-dere vækst og udvikling af fiskeembryoner og -unger. Alle forekommende vita-miner i fisk betragtes som essentielle, men de forskellige typer af vitaminer harforskellige egenskaber, der desuden kan være afhængige af, hvilket udviklings-stadium fiskene befinder sig på (Lall & Lewis-McCrea 2007; Hamre et al. 2010).Vitaminniveauerne samt balancen mellem forskellige vitaminer og forskelligevarianter af de enkelte vitaminer er styret af en række essentielle biologiskeprocesser dels i de voksne moderfisk, dels inde i æg og ungerne.Vitaminindholdet i fiskeæg afhænger især af moderfiskenes fødeindtag, men enrække undersøgelser har vist, at forskellige miljøfarlige stoffer kan påvirke vita-minniveauerne i fisk, bl.a. ved at påvirke genekspressionen, produktionen ellerden metaboliske omdannelse af de enkelte vitaminer, fx via effekter på aryl hy-drocarbon receptoren (AhR), retinoid receptorer eller cytochrom P450 (CYP)-enzymer (se fx review af Novak et al. 2008). De udvalgte vitaminer i denne un-dersøgelse er vitamin A, vitamin E og vitamin B (thiamin).Vitamin A er særlig vigtig for knoglebygningen og udvikling af væv og organer ifiskeembryoner, idet det indgår som signalstof i bl.a. osteoblaster, som er cellerder er ansvarlige for knoglebygning, men også i andre typer af cellers differenti-ering og vækst (Lall & Lewis-McCrea 2007; Hamre et al. 2010). For lave niveaueraf vitamin A i moderfisk og deres æg kan derved være en direkte årsag til udvik-ling af misdannede ålekvabbeunger.En række undersøgelser har påvist kobling mellem lave niveauer af vitamin A ifisk og effekter på CYP-enzymsystemet, udvikling af oxidativt stress og fore-komst af misdannelser samt belastning med miljøfarlige stoffer, herunder PAH,dioxinlignede forbindelser og pesticider (Doyon et al. 1999; Rolland 2000; No-vak et al. 2008). Det tyder desuden på, at vitamin A-niveauet især har betydningfor udviklingen af misdannede fiskeunger i løbet af de første to uger efter æg-gene er befrugtet og klækket (Villeneuve et al. 2005). Vitamin A, der i denneundersøgelse måles med LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry),

opgøres her som summen af all-trans retinol og 13-cis retinol, hvoraf 13-cis re-tinol udgør ca. 5-10 %.Vitamin E er en antioxidant, der bl.a. deltager i reguleringen af redoxbalancen,og er derved vigtig for at modvirke effekter af oxidativt stress. Vitamin E virkerved at bekæmpe skadelige frie radikaler, som er dannet på grund af oxidativtstress i de knogledannende celler (osteoblaster). Vitamin E har desuden en vig-tig rolle for knoglebygningen, hvilket dog mest er kendt for terrestriske hvirveldyrog i mindre grad for fisk (Lall & Lewis-McCrea 2007; Hamre et al. 2010). Dervedkan et lavt niveau af vitamin E også være en årsag til udvikling af misdannelser.En undersøgelse af effekter af dioxinlignende forbindelser på udviklingen af fi-skeyngel viste, at vitamin E er vigtig for at beskytte dels mod oxidativt stress,dels mod udvikling af misdannelser (Na et al. 2009). Vitamin E måles i denneundersøgelse som alfa-tocopherol ved de samme LC-MS analyser som for vi-tamin A.Vitamin B, også kaldet thiamin, er ligeledes vigtig for udviklingen og vækst affiskelarver. Lave vitamin B-niveauer i fiskeæg er bl.a. koblet til tidlig død, og detsåkaldte M74-syndrom i laksefisk fra Østersøen (Amcoff et al. 2002; Vuori & Ni-kinmaa 2007) og de nordamerikanske søer (Fisher et al. 1998; Werner et al.2006). Lakseyngel, der har udviklet M74-syndromet, har en meget høj dødelig-hed, og de typiske symptomer omfatter bl.a. neurologiske forstyrrelser og skaderpå blodkredsløb og indre organer (Lundstrom et al. 1999; Vuori & Nikinmaa2007).Mangel på vitamin B i fisk er ofte sammenkædet med et lavt niveau af antioxi-danter som fx vitamin E og deraf følgende oxidativt stress, som kan overføresfra moderfisk til æg. De bagvedliggende årsager til dette er endnu uafklarede ogkan omfatte både biotiske og abiotiske forhold. Det er foreslået, at årsagen mu-ligvis kan tillægges ændringer i laksens fødesammensætning pga. en høj eutro-fiering og deraf ændret struktur af fødekæderne i Østersøen, men det kan ikkeudelukkes, at oxidativt stress i fiskene også kan skyldes effekter fra miljøfarligestoffer som fx dioxinlignende stoffer og andre halogenerede stoffer som fx bro-merede flammehæmmere (Vuori & Nikinmaa 2007).Vitamin B, der i denne undersøgelse også måles med LC-MS, opgøres somsummen af følgende tre thiaminforbindelser: frit thiamin, thiaminmonophosphat(TMP) og thiaminpyrophosphat (TPP).

Der var forskelle i vitaminniveauerne i ålekvabber fra de tre lokaliteter og på deforskellige indsamlingstidspunkter (figur4).Vitamin A-niveauet var noget højere ved Agersø end på de to andre stationer,og især i æggene fra august, hvilket kan tyde på, at æg fra ålekvabbe indsamletved Roskilde og Frederiksværk var af ringere kvalitet end dem fra Agersø. For-skellen var dog ikke signifikant. I november var niveauet generelt højere end iaugust og september og mere ensartet mellem de tre stationer, hvilket kan tydepå en aktiv overførsel af vitamin A fra moderfiskene til deres unger. I septem-ber, hvor der ikke var data fra Agersø, var vitamin A-niveauet i ungerne signifi-kant forskellige, idet de var markant højere (ANOVA; p < 0,01) ved Roskildeend ved Frederiksværk.For vitamin E's vedkommende ses en lignende tendens, idet indholdet i æg ind-samlet i august og i unger fra november var højere i prøver fra Agersø end frade øvrige stationer. Forskellene mellem områderne var signifikante både i au-gust (ANOVA, p < 0,05), september (ANOVA, p < 0,05) og november (ANOVA,p < 0,01). Dette tyder igen på, at æg fra Roskilde og Frederiksværk har en rin-gere kvalitet, idet de er mindre beskyttede mod oxidativt stress. Modsat for vi-tamin A falder niveauet af vitamin E fra æg til unger, hvilket kan tyde på, at det imindre grad løbende overføres fra moderfisk til ungerne.Vitamin B-niveauerne var lavest ved Roskilde, men til gengæld var Frederiks-værk højest og nogenlunde på niveau med Agersø. Roskilde var signifikant for-23

Steroider i blod og ovarievæske fra voksne hunnerLigesom for vitaminer kan en række forskellige steroider, dvs. hormoner, havestor betydning for den videre vækst og udvikling efter fiskeæg er klækket. Deforskellige steroider har forskellige virkemekanismer, og de har ikke kun betyd-ning for kønsudvikling. Steroidniveauerne samt balancen mellem forskellige ste-roider er styret af en række essentielle biologiske processer i både de voksnemoderfisk og inde i æg og ungerne.Mange miljøfarlige stoffer virker hormonforstyrrende og kan derved påvirkehormonbalancen i fisk, bl.a. ved at påvirke særlige receptorer for genekspres-sion, produktionen eller den metaboliske omdannelse af de enkelte steroider, fxvia effekter på cytochrom P450 (CYP)-enzymer. Nedsatte steroidniveauer kanskyldes effekter som bl.a. hæmning af processer i bl.a. steroid-producerendeorganer som hypothalamus eller hypofysen, nedsatte kolesterolniveauer, på-virkning af aktiviteten af de forskellige enzymer der indgår i steroidgenesen ellerøget metabolisme i leveren og deraf følgende ekskretion (Kime 1995).Steroiderne blevet analyseret i de voksne moderfisk, hhv. i blodet fra ålekvab-ber indsamlet i august og i ovarievæske fra ålekvabber indsamlet i septemberog november. De kan inddeles i følgende fire overordnede grupper:•

undersøgelser har også vist, at høje østrogenniveauer kan forårsage mis-dannelser i fisk (Urushitani et al. 2002).I denne delrapport er tolkningen af de områdemæssige forskelle baseret på demålte koncentrationsniveauer af disse fire grupper af steroider, men det kan ikkeudelukkes, at eventuelle effekter på hormonsystemet i højere grad vil vise sigsom udslag i niveauerne af de enkelte specifikke steroider, eller som de relativeforhold imellem de forskellige typer af steroider.Overordnet er der betydelige områdemæssige forskelle i steroidniveauerne målti både blod fra voksne ålekvabber ved indsamlingen i august og i ovarievæskenfra indsamlingen i september og november (figur5 og 6).Ålekvabber indsamlet ved Roskilde i august havde et generelt markant højereniveau af alle 4 grupper af steroider i blodet. Fiskene fra Agersø havde det la-veste niveau af hhv. progestagener og glucocortikoider, hvorimod fiskene fraFrederiksværk havde det laveste niveau af androgener og østrogener. Kun ni-veauet af østrogener ved Roskilde var dog signifikant forskellig fra Agersø(ANOVA, p < 0,01).

CYP1A-aktivitet i lever fra voksne hunnerI alle fisk findes cytochrom P450-medierede afgiftningsenzymer, som indgår iden oxidative metabolisme, kaldet fase-I-enzymer. Udover at omdanne en delaf organismens egne stoffer som vitaminer og hormoner, omdanner disse en-zymer, og især enzymerne af typen CYP1A, organiske miljøfarlige stoffer så-som PAH og dioxinlignende stoffer, så de bliver mere vandopløselige og nem-mere at udskille. En vigtig egenskab ved disse enzymer er, at de er inducérbare,dvs. at aktiviteten øges som respons på en stigende påvirkning. En forhøjetCYP1A-enzymaktivitet medfører bl.a. oxidativt stress i form af en øget produkti-on af reaktive metabolitter med særlig høj toksicitet, fx epoxider af PAH, der kanhave en mutagen og kræftfremkaldende virkning ved at forvolde skader påDNA. Disse egenskaber gør CYP1A anvendelig som biomarkør. Man skal dogvære opmærksom på, at sæsonmæssige variationer i enzymaktiviteten er vel-kendte, og forskelle kan også skyldes bl.a. kønsforskelle og reproduktiv status.Det er derfor vigtigt, at der sammenlignes grupper af fisk indsamlet under ens-artede forhold.26

Undersøgelsen viste, at der var områdemæssige forskelle i CYP1A-enzymakti-viteten, der i nogen grad også afhang af indsamlingstidspunktet. På alle tids-punkter blev den højeste enzymaktivitet målt i fisk fra Frederiksværk, efterfulgtaf fisk fra Roskilde. I august var den markant laveste enzymaktivitet ved Agersø,men her var aktiviteten steget noget ved novemberindsamlingen (figur7).I au-gust var CYP1A-aktiviteten både ved Roskilde og Frederiksværk signifikant for-skellig fra Agersø (ANOVA, p < 0,01), men i november var kun Frederiksværksignifikant forskellig (ANOVA, p < 0,05).Dette tyder på, at ålekvabber fra Frederiksværk efterfulgt af fisk fra Roskilde varudsat for den højeste påvirkning af miljøfarlige stoffer som PAH, dioxinlignendeforbindelser eller andre flade polyaromatiske stofgrupper.

Lipid i muskel fra voksne hunner samt æg og ungerLipidniveauet i fisk kan anvendes som et mål for fisks tilgængelige energireser-ver og derved, hvor god ernæringstilstand de er i (Lloret & Planes 2003). Der-udover er lipider en vigtig forudsætning for dannelsen af kolesterol, der er for-udsætningen for de andre steroider, der dannes via steroidgenesen (Kime1995).I denne undersøgelse blev det totale lipidindhold analyseret i de sammenpuljedevævsprøver af hhv. muskel fra voksne hunner og æg og unger fra august ognovember, hvor der også blev analyseret for miljøfarlige stoffer. Dette indebærer,

På den anden side kan det ikke udelukkes, at det højere lipidniveau, ligesomhøjere LSI-værdier, kan være et respons på en forstyrret mobilisering, metabo-lisme og deraf følgende lipiddeponering (Kime 1995). LSI-værdier og/eller andrehistopatologiske forandringer i leveren hos ålekvabbe indsamlet i forskellige in-dustripåvirkede områder bl.a. i England (Stentifordet al. 2003)og i Sverige (Ve-temaa et al. 1997; Sturve et al. 2005)og i laboratorieforsøg med ålekvabber harman bl.a. fundet signifikante øgninger i LSI-værdier ved eksponering til PAH(Celanderet al. 1994).En række andre miljøfaktorer kan dog også have indfly-delse på LSI-værdierne.

Der var en overordnet tendens til, at ålekvabber fra Roskilde og Frederiksværk,hvor de højeste andele af kuld med en øget forekomst af misdannede ungerfindes, havde et afvigende responsniveau af biomarkørerne sammenlignet medreferencestationen ved Agersø, hvor responsniveauet formodes at svare til ennormal tilstand.Dette gjaldt både for niveauerne af vitaminer og steroider, CYP1A, PAH-metabolitter og lipidindhold, men hvilke og i hvilket omfang afhænger dels afden enkelte biomarkør, dels af undersøgelsestidspunktet. Forskellene var isærmarkante i august, hvor 11 ud af de 12 biomarkører i ålekvabber fra Roskilde ogFrederiksværk havde et responsniveau, der afveg mere end 25 % i forhold til ifisk fra Agersø (tabel4).For flere af biomarkørerne var forskellen i responsni-veauet endnu større, fx var afvigelsen for 7 ud af de 12 biomarkører større end50 %. I september og november adskilte responsniveauet for cirka halvdelen afbiomarkørerne ved Roskilde og Frederiksværk sig med mere end 25 % fra ni-veauerne ved Agersø, setabel 5og6.De indbyrdes forskelle mellem Roskilde og Frederiksværk er dog ikke helt enty-dige, da Roskilde adskiller sig mest i august og november og Frederiksværkmest i september. I den anledning skal det nævnes, at pga. en mislykket ind-samling af ålekvabbe ved Agersø i september, er vurderingen af data fra sep-tember udført relativt i forhold til data fra ålekvabbe fra Agersø indsamlet ved deto andre tidspunkter, se også bemærkning tiltabel 5.Tabel 4. Sammenligning af middelværdier for responsniveauet for de forskellige an-vendte biomarkører i ålekvabbe ved de tre lokaliteter i august. Farveskalaerne angiverresponsniveauet i forhold til referencestationen ved Agersø på hhv. mindre end +/- 25 %(hvid), mellem +/- 25 % og > +/- 50 % (lysegrå) og større end +/- 50 % (mørkegrå).AugustKI, voksneLSI, voksneLipid, voksneCYP1A, voksnePAH-metabolitter, voksneVitamin A, ægVitamin E, ægVitamin B, ægProgestagener, voksneGlucocortikoider, voksneAndrogener, voksneØstrogener, voksneAgersø0,42 %1,74 %1,8 %2,20,930,832485513,441,825,61,8Roskilde0,52 %2,06 %4,5 %12,02,430,471374045,272,529,35,9Frederiksværk0,53 %2,01 %6,5 %13,12,870,571706418,353,213,51,1

Tabel 5. Sammenligning af middelværdier for responsniveauet for de forskellige bio-markører i ålekvabbe i september. Farveskalaerne angiver responsniveauet i forhold tilreferencestationen ved Agersø på hhv. mindre end +/- 25 % (hvid), mellem +/- 25 % og> +/- 50 % (lysegrå) og større end +/- 50 % (mørkegrå). Vurdering af data fra septemberfra Frederiksværk og Roskilde er udført relativt i forhold til enten data fra Agersø i no-vember (*), eller en middel af data fra Agersø i august og november (**), eventuelt juste-ret for en relativ tidslig forandring af data fra september til november (***).SeptemberType (B-G)*Type 0*Kuldstørrelse*Længde af unger***KI**LSI**CYP1A**PAH-metabolit**Vitamin A*Vitamin E*Vitamin B***Progestagener*GlucocortikoiderAndrogener*Østrogener*Agersø---------------Roskilde5,0 %15,0 %103,922,40,49 %2,05 %8,91,752,434714,1643609225659Frederiksværk8,2 %16,7 %109,520,60,47 %1,90 %15,33,801,015820,2111817833839135

Tabel 6. Sammenligning af middelværdier for de forskellige biomarkører i ålekvabbe inovember. Farveskalaerne angiver responsniveauet i forhold til referencestationen vedAgersø på hhv. mindre end +/- 25 % (hvid), mellem +/- 25 % og > +/- 50 % (lysegrå) ogstørre end +/- 50 % (mørkegrå).NovemberType (B-G)Type 0KuldstørrelseLængde af ungerKILSILipid, voksneCYP1APAH-metabolitVitamin AVitamin EVitamin BProgestagenerGlucocortikoiderAndrogenerØstrogenerAgersø0,0 %10,0 %89,229,80,41 %1,47 %-8,62,462,729314,9413607230125Roskilde9,5 %14,3 %102,831,70,46 %2,25 %2,9 %10,72,852,694511,112513521849508Frederiksværk10,0 %12,0 %82,330,60,40 %1,76 %1,8 %15,92,982,395415,92555411505309

De lavere niveauer af både vitamin A og E i æg ved Roskilde og Frederiksværksammenlignet med ved Agersø i august kan være et tegn på, at disse æg ermere sårbare for at udvikle misdannede unger, når de klækkes, da både vitaminA og E vides at være vigtige for fisks knoglebygning. Niveauet af vitamin B erdesuden lavere i æg fra Roskilde, men ikke ved Frederiksværk. Ved de senereundersøgelser af vitaminer i ålekvabbeunger indsamlet i september og novem-ber, var niveauet af vitamin E fortsat lavere ved disse stationer sammenlignetmed Agersø. Vitamin A var stadig lavest ved Frederiksværk, og vitamin B vedRoskilde.CYP1A-aktiviteten i leveren og niveauet af PAH-metabolitter i galde fra de gra-vide hunner, især i august, adskiller sig tilsvarende ved Roskilde og Frederiks-værk, hvilket styrker formodningen om, at de lavere vitaminniveauer er forårsa-get af en øget belastning med visse grupper af miljøfarlige stoffer og ikke for-skelle i andre biotiske og abiotiske forhold så som fødegrundlaget. Flere uden-landske undersøgelser har tidligere sammenkædet lave niveauer af vitamin A ifiskeæg med effekter på CYP-enzymsystemet, udvikling af oxidativt stress ogforekomst af misdannelser samt belastning med miljøfarlige stoffer, herunderPAH, men også dioxinlignede forbindelser og andre halogenerede stofgrupper

som pesticider og bromerede flammehæmmere (fx Doyon et al. 1999; Rolland2000; Novak et al. 2008).Ligeledes er lave niveauer af antioxidanten vitamin E blevet forbundet med enøget risiko for oxidativt stress fra miljøfarlige stoffer (fx Na et al. 2009). Niveauetaf vitamin B i ålekvabber følger dog kun ved Roskilde og ikke ved Frederiks-værk de tilsvarende lavere vitamin E-niveauer. Andre udenlandske undersøgel-ser med laksefisk sammenkæder dog niveauet af vitamin B med niveauet af an-tioxidanter som fx vitamin E (Vuori & Nikinmaa 2007).De markant højere niveauer af bl.a. glucocortikoider i blodet i ålekvabberne iaugust fra især Roskilde, men også Frederiksværk, tyder på, at disse fisk varudsat for en højere grad af stress, som muligvis kan være forårsaget af miljøfar-lige stoffer. Yderligere kan det højere niveau af progestagener og østrogener iålekvabber indsamlet ved især Roskilde muligvis udgøre en risiko for at unger-ne i højere grad udvikler misdannelser. Det er umiddelbart vanskeligt at vurde-re, om det højere niveau af androgener eventuelt også kan have en betydning idenne sammenhæng.At de områdemæssige forskelle i steroidniveauerne ligesom for vitaminerne og-så synes at afhænge af indsamlingstidspunktet skyldes sandsynligvis, at stero-idgenesen er en dynamisk proces, hvor niveauerne og balancen mellem steroi-der ændrer sig igennem hele den reproduktive periode, og sådanne forandrin-ger kan ske selv inden for ganske korte tidsperioder (Kime 1995). Desuden vilde forskellige typer af steroider formentlig ikke alle i samme grad blive overførtfra blod til ovariet. En anden mulig faktor kan være, at både det ydre belast-ningsniveau med forskellige grupper af miljøfarlige stoffer og den i ålekvabber-ne interne fordeling mellem forskellige organer og deraf følgende påvirkning afålekvabberne også kan variere mellem august, september og november for detre undersøgte lokaliteter i 2009.Det er umiddelbart vanskeligt at vurdere, hvorvidt de områdemæssige forskelle isteroidniveauerne eventuelt kan skyldes decideret øget belastning med hor-monforstyrrende stoffer, eller eventuelt beror på andre biotiske eller abiotiskeforhold.Ligeledes er de områdemæssige forskelle i lipidindholdet sammen med lever-somatisk indeks (LSI) og konditionsindekset (KI) vanskelige at vurdere i relationtil en øget belastningsgrad med miljøfarlige stoffer, da disse også kan være for-årsaget af andre miljøforhold som fx forskelle i udvalget af de foretrukne føde-emner.

Det skal bemærkes, at de ovennævnte vurderinger af de områdemæssige for-skelle i responsniveauet for de forskellige biomarkører er baseret dels på data,som er sammenstillet på stationsniveau, dels på de totale niveauer af de over-ordnede grupper af både vitaminer og steroider. Det kan ikke udelukkes, ateventuelle effekter på vitamin- eller hormonsystemet bedre kan vurderes påbaggrund af en mere detaljeret vurdering dels på individniveau for hver under-søgt ålekvabbe, dels af de enkelte specifikke varianter af vitaminer og/eller ste-roider, eller som de relative forhold imellem dem.Den overordnede vurdering af disse biomarkørundersøgelser indikerer, at årsa-gen til den øgede forekomst af ålekvabbekuld med misdannede unger ved Ros-kilde og Frederiksværk i september og november kan relateres til lavere ni-veauer af vitamin A, vitamin E og vitamin B, og at forskelle i vitaminer mellemRoskilde og Frederiksværk skyldes forskelle i eksponering for miljøfarlige stof-fer. De lavere vitaminniveauer kan skyldes effekter på CYP-enzymsystemetog/eller oxidativt stress, som er forårsaget af en øget belastning med miljøfarli-ge stoffer som PAH, dioxinlignede forbindelser og/eller andre halogeneredestofgrupper som pesticider og bromerede flammehæmmere. Det skal i denneforbindelse nævnes, at disse stoffer i regelen vil forekomme som komplekseblandinger i vandmiljøet, og at det ikke kan udelukkes, at andre grupper af mil-jøfarlige stoffer, fx tungmetaller som kobber og kviksølv, der også kan forårsageoxidativt stress i fisk (Ferreira et al. 2008), kan have effekter på niveauerne afde essentielle vitaminer, der er vigtige for knoglebygningen i fisk.

Der er indikationer på, at årsagen til den øgede forekomst af ålekvabbekuldmed misdannede unger ved Roskilde og Frederiksværk kan relateres til lavereniveauer af vitamin A, E og B. For vitamin E, som bl.a. beskytter mod oxidativstress, er det tilfældet både i august og i november. De laveste niveauer af vi-tamin A fandtes gennemgående ved Frederiksværk, og de lavest niveauer afvitamin B blev fundet ved Roskilde. Dette kan skyldes tilstedeværelse af forskel-lige typer af miljøfarlige stoffer. Tilsvarende adskiller CYP1A-aktiviteten i leve-ren og niveauet af PAH-metabolitter i galde fra de gravide hunner sig især i au-gust ved Roskilde og Frederiksværk i forhold til Agersø. Dette styrker formod-ningen om, at de lavere vitaminniveauer er forårsaget af en øget belastningmed visse grupper af miljøfarlige stoffer, og ikke forskelle i andre biotiske ogabiotiske forhold så som forskelle i fødegrundlaget.Konklusionerne fra måleprogrammet er, at:•

Amcoff, P., Åkerman, G., Tjänlund, U., Börjeson, H., Norrgren, L., Balk, L. 2002:Physiological, biochemical and morphological studies of Baltic salmon yolk-sac fry with an experimental thiamine deficiency: relations to the M74 syn-drome. - Aquatic Toxicology 61: 15-33.Celander, M., Näf, C., Bromand, D. & Förlin L. 1994: Temporal aspects of in-duction of hepatic cytochrome P450 1A and conjugating enzymes in the vivi-parus blenny (Zoarcesviviparus)treated with petroleum hydrocarbons. -Aquatic Toxicology 29(3-4): 183-196.Christian, M.S., Brent, R.L. & Calda, P. 2007: Embryo-fetal toxicity signals for17α-hydroxyprogesterone caproate in high-risk pregnancies: A review of thenon-clinical literature for embryo-fetal toxicity with progestins. - The Journal ofMaternal-Fetal & Neonatal Medicine 20: 89-112.Doyon, C., Fortin, R., Spear, P.A. 1999: Retinoic acid hydroxylation and terato-genesis in lake sturgeon (Acipenserfulvescens)from the St. Lawrence Riverand Abitibi Region, Quebec. - Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sci-ence 56: 1428-1436.Ferreira, M., Caetano, M., Costa, J., Pousão-Ferreira, P., Vale, C. & ArmandaReis-Henriques, M. 2008: Metal accumulation and oxidative stress responsesin, cultured and wild, white seabream from Northwest Atlantic. - Science ofThe Total Environment 407: 638-646.Fisher, J.P., Brown, S.B., Wooster, G.W., Bowser, P.R. 1998: Maternal blood,egg and larval thiamin levels correlate with larval survival in landlocked Atlan-tic salmon (Salmosalar).- The Journal of Nutrition 128: 2456-2466.Halling-Sørensen, B., Petersen, G., Stuer-Lauridsen, F., Slothuus, T., Kinnberg,K., Bjerregaard, P. 2008: Kemiske stoffer der kan føre til misdannelser i fisk.Indkredsning af stoffer ud fra deres biokemiske virkemekanisme. Rapport fraBy- og Landskabssyrelsen 2008, 112s.http://www2.blst.dk/udgiv/Publikationer/2008/978-87-92256-41-6/pdf/978-87-92256-42-3.pdf

Hamre, K., Krossøy, C., Lock, E.-J., Moren, M. 2010: Roles of lipid-soloble vi-tamins during ontogeny of marine fish larvae. - Aquaculture Research 41:745-750.ICES/OSPAR 2008: Report of the Fourth ICES/OSPAR Workshop on Inte-grated Monitoring of Contaminants and their Effects in Coastal and Open SeaAreas (WKIMON IV), 5–7 February 2008, ICES, Copenhagen, Denmark,ICES CM 2008/ACOM:49, 80 pp.Kime, D.E. 1995: The effects of pollution on reproduction in fish. - Reviews inFish Biology and Fisheries, 5: 52-96.Kortner, T.M., Rocha, E. & Arukwe, A. 2003: Androgenic Modulation of EarlyGrowth of Atlantic Cod (Gadus morhua L.) Previtellogenic Oocytes and ZonaRadiata-Related Genes. - Journal of Toxicology and Environmental Health,Part A, 72: 184–195.

Lall, S.P., Lewis-McCrea, L.M. 2007: Role of nutrients in skeletal metabolismand pathology in fish - An overview. - Aquaculture 267: 3-19.Lloret, J. & Planes, S. 2003: Condition, feeding and reproductive potential ofwhite seabreamDiplodus sargusas indicators of habitat quality and the effectof reserve protection in the northwestern Mediterranean. - Marine EcologyProgress Series 248: 197-208.Lundstrom, J., Börjeson, H., Norrgren, L. 1999: Histopathological studies of yolksac fry of Baltic salmon (Salmonsalar)with the M74 syndrome. - Ambio 28:16-23.Mommsen, T.P., Vijayan, M.M., Moon, T.W. 1999: Cortisol in teleosts: dynam-ics, mechanisms of action, and metabolic regulation. - Review in Fish Biologyand Fisheries 9: 211-268.Na, Y.-R., Seok, S.-H., Baek, M.-W., Lee, H.-Y., Kim, D.-J., Park, S.-H., Lee, H.-K., Park, J.H. 2009: Protective effects of vitamin E against 3,3',4,4',5-penta-chlorobiphenyl (PCB126) induced toxicity in zebrafish embryos. - Ecotoxi-cological and Environmental Safety 72: 714-719.Novak, J., Bensek, M., Hilscherova, K. 2008: Disruption of retinoid transport,metabolism and signalling by environmental pollutants. Environment Interna-tional 34: 898-913.OSPAR 1998a: JAMP (Joint Assessment and Monitoring Programme), JAMPguidelines for general biological effects monitoring. Oslo and Paris Commis-sions, 15 pp.OSPAR 1998b: JAMP (Joint Assessment and Monitoring Programme), JAMPguidelines for contaminant-specific biological effects monitoring. Oslo andParis Commissions, 38 pp.Rolland, R.M. 2000: A review of chemically-induced alterations in thyroid andvitamin A status from field studies of wildlife and fish. - Journal of Wildlife Dis-eases 36: 615-635.Stentiford, G.D., Longshaw, M., Lyons, B.P., Jones, G., Green, M. & Feist, S.W.2003: Histopathological biomarkers in estuarine fish species for the assess-ment of biological effects of contaminants. - Marine Environmental Research55:137-159.Strand, J., Andersen, L., Dahllöf, I. & Korsgaard, B. 2004: Impaired larval de-velopment in broods of eelpout (Zoarces viviparus) in Danish coastal waters. -Fish Physiology and Biochemistry 30: 37-46.Strand, J. & Dahllöf, I. 2005: Teknisk anvisning for marin overvågning. 4.5Biologisk effektmonitering - muslinger. NOVANA. Danmarks Miljøundersøgel-ser. - Teknisk anvisning fra DMU's Marine Fagdatacenter. 15 s.Strand, J., Dahllöf, I. & Larsen, M.M. 2009: Biologisk effektmonitering; - I: Dahl,K. & Josefson, A.B. (red.): Marine områder 2007, Danmarks Miljøundersøgel-ser, Aarhus Universitet. - Faglig rapport fra DMU nr. 707. s. 62-63.

Sturve, J., Berglund, A., Balk, L., Broeg, K., Bohmert, B., Massey, S., Sav-va,D., Parkkonen, J., Stephensen, E., Koehler, A. & Forlin, L. 2005: Effects ofdredging in Goteborg Harbor, Sweden, assessed by biomarkers in eelpout(Zoarcesviviparus).- Environmental Toxicology and Chemistry 24: 1951-1961.Urushitani, U., Shimizu, A., Katsu, Y., Iguchi, T. 2002: Early estrogen exposureinduces abnormal development ofFundulus heteroclitus.Journal of Experi-mental Zoology 293: 693-702.Vetemaa, M., L. Förlin, and O. Sandström. 1997. Chemical industry effluent im-pacts on reproduction and biochemistry in a North Sea population of vivipa-rous blenny (Zoarces viviparus). Journal of Aquatic Ecosystem Stress andRecovery 6: 33-41.Villeneuve, L., Gisbert, E., Zambino-Infante, J., Quazuguel, L., Cahu, P. 2005:Effect of nature of dietary lipids on European sea bass morphogenesis: impli-cations of 12 retinoid receptors. British Journal of Nutrition 94: 83-89.Vuori, K.M., Nikinmaa, M. 2007: M74 syndrome in Baltic salmon and the pos-sible role of oxidative stresses in its development: Present knowledge andperspectives for future studies. Ambio 36: 168-172.Werner, R.M., Rook, B., Greil, R. 2006: Egg-thiamine status and occurrence ofearly mortality syndrome (EMS) in Atlantic salmon from St. Marys River,Mitchigan. J. Great Lakes 32: 293-303.